Otimização das condições de cultivo e caracterização parcial da lipase produzida por Yarrowia divulgata

Lipases are classified as hydrolases and have the function of catalyzing reactions of total or partial hydrolysis of triglycerones in diacylglycerols, monoglycerols and liberating free fatty acids and glycerol in an oil-water interface. These enzymes are obtained through solid culture or in submerged culture. The submerged fermentation is used in the production of enzymes due to the advantages of more efficient operation in relation to pH, temperature, oxygen ratio, carbon /nitrogen ratio. The objective of this work was to study the best conditions of submerged culture for the production of lipase at 30 °C and 150 rpm for 48 h of culture by yeast Yarrowia divulgata, using factorial experiments (DCCR) to evaluate the effect of the variables, oil concentration and pH, using olive oil and residual soybean oil as carbon sources. Lipase production was compared in the 2 oils and the best condition found was used for evaluation of lipase production in bench bioreactor at 28 °C for 72 h of culture with stirring variation between 200 and 400 rpm. The influence of the addition of surfactants and emulsifiers (Tween 20, soy lecithin and xanthan gum) on lipase production was also evaluated. The lipase produced was characterized as the activity and stability at different temperatures, pH, metal ions and the effect of solvents and surfactant on the enzymatic activity. The results obtained in the DCCR (22) indicate that, among the carbon sources tested, olive oil provided higher production, with activity of 67.0 U.mL-1 at pH5.3 and 9.97 g.L-1 of oil. Using residual soybean oil the lipase production was 36.0 U.mL-1 at pH 5.0 and 16.22 g.L-1 oil. In the comparison between the two oils, the activity was higher in olive oil (57.0 U.mL-1) compared to residual soybean oil (30.8 U.mL-1). The assays in bench-top bioreactor using olive oil as carbon source showed more expressive results of 300 rpm (2.939 U.mL-1) agitated lipolytic activity and the highest cell count (2.56x109 cells.mL-1) was obtained at 400 rpm, after 48 h of culture. The assays at 200 rpm showed less activity and less accumulation of cells during 72h of culture. EEB showed stability in the range of pH 3.0 to 8.0, with lipolytic activity above 50% and pH 3.0 to 6.0 with residual activity close to 100%. The Mn2+ ion was the only one responsible for providing EEB activation at concentrations of 5mM and 10mM, and the Mg2+, Zn2+ and Ca2+ ions presented in EEB activation effect only at 5mM concentration. Surfactants negatively influenced lipolytic activity, with the exception of Triton X-100 (1%). The organic solvents presented activation of the lipase only in 1% and DMSO had a positive influence in 1% and 10%.Lipases são classificadas como hidrolases e apresentam função de catalisar reações de hidrólise total ou parcial de triglicerois em diacilglicerois, monoglicerois e liberando ácidos graxos livres e glicerol em uma interface óleo-água. Estas enzimas são obtidas através do cultivo sólido ou em cultivo submerso. A fermentação submersa é utilizada na produção de enzimas em virtude das vantagens de operação mais eficiente em relação a pH, temperatura, taxa de oxigênio, relação carbono nitrogênio. No presente estudo objetivou-se estudar as melhores condições de cultivo submerso para a produção de lipase a 30°C e 150 rpm durante 48 h de cultivo pela levedura Yarrowia divulgata, utilizando-se experimentos fatoriais (DCCR) para se avaliar o efeito das variáveis, concentração de óleo e pH, utilizando óleo de oliva e óleo de soja residual como fontes de carbono. A produção de lipase foi comparada nos 2 óleos e a melhor condição encontrada foi utilizada para a avaliação da produção da lipase em biorreator de bancada a 28°C durante 72h de cultivo com variação da agitação entre 200 e 400 rpm. Foi avaliada também a influência da adição de surfactantes e emulsificantes (Tween 20, lecitina de soja e goma xantana) na produção da lipase. A lipase produzida foi caracterizada quanto a atividade e estabilidade em diferentes temperaturas, pH, íons metálicos e quanto ao efeito de solventes e surfactante na atividade enzimática. Os resultados obtidos no DCCR (22) indicam que, entre as fontes de carbono testadas, o óleo de oliva proporcionou maior produção, com atividade de 67,0 U.mL-1 em pH 5.3 e 9,97 g.L-1 de óleo. Utilizando óleo de soja residual a produção de lipase foi de 36,0 U.mL-1 em pH 5.0 e 16,22 g.L-1 de óleo. Na comparação entre os dois óleos, a atividade foi maior em óleo de oliva (57,0 U.mL-1) em comparação ao óleo de soja residual (30,8 U.mL-1). Os ensaios em biorreator de bancada utilizando óleo de oliva como fonte de carbono apresentaram resultados mais expressivos de atividade lipolítica em agitação de 300 rpm (2,939 U.mL-1) e a maior contagem celular (2,56x109 células.mL-1) foi obtida em 400 rpm, após 48h de cultivo. Os ensaios a 200 rpm apresentaram menor atividade e menor acúmulo de células durante 72h de cultivo. O EEB apresentou estabilidade em faixa de pH 3.0 a 8.0, com atividade lipolítica acima de 50% e de pH 3.0 a 6.0 com atividade residual próxima dos 100%. O íon Mn2+ foi o único responsável por proporcionar ativação do EEB nas concentrações de 5mM e 10mM e os íons Mg2+, Zn2+ e Ca2+ apresentaram efeito de ativação do EEB apenas em concentração de 5mM. Os surfactantes influenciaram de forma negativa na atividade lipolítica, com exceção do Triton X-100 (1%). Os solventes orgânicos apresentaram ativação da lipase apenas em 1% e o DMSO apresentou influência positiva em 1% e 10%