Ecologia evolutiva dos poliploides: compreender a coexistência de espécies em zonas de contacto

Tese de Doutoramento em Biociências, na especialidade de Ecologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraCytogenetic diversity is widely observed in numerous organisms. In flowering plants, diversification and evolution are intimately related with polyploidization events throughout their entire evolutionary history. Polyploid formation is frequent in nature, however, the establishment of new entities is not always successful. The changes generated by polyploidization have profound consequences in the genetics, morphology, physiology and mating system of a plant, affecting plant performance and leading to divergence. After formation, polyploids may be eliminated from parental populations due to selective pressures against rare cytotypes, or polyploidization may have conferred an advantage allowing polyploids to escape frequency-dependent selection. This advantage might enable polyploids to outcompete their progenitors and/or suit the new polyploid with broader environmental tolerances enabling the dispersal to new habitats. Cytotype coexistence will be possible if a set of barriers promote assortative mating. The main goal of this PhD Thesis was to understand the role of polyploidization in plant diversification by focusing on the ecological processes involved with the successful establishment and spread of polyploid lineages. I have focused in three different levels: in situ cytogeographical patterns and environmental association in different polyploid complexes; interaction between cytotypes at contact zones; direct consequences of whole genome duplication versus post-polyploidization adaptation. Large-scale screenings to determine DNA-ploidy levels were performed along the distribution range of Jasione maritima and J. montana, in the latter mostly focusing in the contact zone at the northwest of the Iberian Peninsula, and environmental requirements of each cytotype were assessed. Diploids were reported for the first time in J. maritima, with the cytotypes being allopatrically distributed: diploids occur in northern dunes, while tetraploids are present in drier and hotter locations of central and south areas of the species distribution. The broader environmental niche shown by tetraploids suggests that polyploidization may have changed the ecological requirements, allowing the colonization and establishment in southern areas, partially explaining the current distribution patterns. The restricted distribution of diploids highlights the need for cytotype targeted conservation measures. In J. montana, the cytotypes were parapatrically distributed forming several contact zones, with diploids having broader environmental and geographic niches than tetraploids. In this polyploid complex, polyploidization does not seem to have driven shifts in ecological preferences of tetraploids, and thus other factor are expected to be involved with the current distribution patterns. The tetraploid-octoploid Gladiolus communis was used to explore cytotype interactions at contact zones using a high-ploidy level complex. First, cytogenetic diversity, distribution patterns and environmental requirements were explored. Tetraploids and octoploids were dominant and, despite a high degree of geographic isolation, it was also shown that they grow in sympatry in several populations. Environmental requirements between cytotypes were similar, suggesting that polyploidization does not seem to have generated a shift in environmental preferences. The detection of hexaploids and mixed-ploidy populations suggested that hybridization and unreduced gamete production are frequent events, which points for recurrent polyploid formation and gene flow. Consequently, reproductive barriers between cytotypes enabling coexistence were explored, in particular, temporal, behavioral, mechanical and gametic barriers. Pre-pollination barriers were weak, while post-pollination interactions were strong and variable depending on pollen loads, and consequently a reflection of population structure. Controlled pollinations suggest that, after formation, a lower fitness will exclude the polyploid from the population, unless unreduced gametes formation ameliorate this disadvantage, while in later stages, strong post-zygotic barriers may enable cytotype coexistence. Considering that J. maritima cytotype distribution was only partially explained by environmental variables, the role of polyploidization driving different competitive abilities between cytotypes was explored. The direct consequences of whole genome duplications were evaluated using diploids, neotetraploids and established tetraploids, being the use of neotetraploids a key innovation. As it was not possible to detect neotetraploids in natures, a protocol was established to successfully synthetize neotetraploids in the laboratory, using colchicine treatments applied to natural diploids. Afterwards, diploids, neotetraploids and tetraploids were grown with and without competition in controlled conditions. Results showed that polyploidization did not affect competitiveness, and thus, it may have not played a significant role for polyploid establishment. However, similar competitive abilities at the contact zone may be responsible for the maintenance of a stable contact zone. Also, differential competitive abilities of cytotypes across the distribution area of J. maritima, possibly linked with adaptations to environmental gradients, could have contributed for the current allopatric distribution of this species. In conclusion, the consequences of polyploidization were broad and variable, being highly species-specific. With this PhD Thesis, I observed that polyploidization may partially change ecological requirements of polyploid entities and broaden the niches of cytotypes, allowing the colonization of new environments. However, this was not observed in all studied complexes. Indeed, in some cases, other factors were involved with polyploid establishment and spread. Reproductive barriers between cytotypes were determinant in inter-cytotype interactions and crucial for the establishment of the new cytotype at the contact zones. Also, genome duplications drove some developmental changes, but shifts in competitiveness were not so clear, despite differences in competitive ability between diploids and established tetraploids enabled to explain current distribution patterns. The results obtained in this PhD Thesis open several avenues for research regarding polyploidy. Clearly, more studies focusing on the ecological processes, both in natural populations and under controlled conditions, are needed to understand the conditions responsible for the successful establishment and spread of polyploids and, consequently to understand the pervasive occurrence of polyploidization in flowering plants and its role in plant evolution and diversification.A diversidade citogenética é amplamente observada em inúmeros organismos. Nas plantas com flor, a diversificação e a evolução estão intimamente relacionadas com eventos de poliploidização ao longo de toda a sua história evolutiva. A formação de poliploides é frequente na natureza, contudo, o estabelecimento de novas entidades nem sempre é bem-sucedido. As alterações geradas pela poliploidização têm profundas consequências na genética, morfologia, fisiologia e sistema reprodutivo da planta, afetando o êxito da planta e levando a fenómenos de divergência. Depois da sua formação, os indivíduos poliploides podem ser eliminados da população parental através de pressões seletivas que afetam o citotipo minoritário, ou, por sua vez, a poliploidização pode conferir uma vantagem que permite ao poliploide escapar da seleção dependente da frequência. Esta vantagem pode permitir ao poliploide excluir os seus progenitores e/ou capacitá-lo com tolerâncias ambientais mais amplas que permitirão a sua dispersão para novos habitats. A coexistência dos citotipos será possível se um conjunto de barreiras reprodutivas promoverem cruzamentos seletivos. O principal objetivo desta Tese de Doutoramento foi perceber o papel da poliploidização na diversificação das plantas, focando-se nos processos ecológicos envolvidos no estabelecimento e na dispersão com sucesso de linhagens poliploides. Para o efeito, foquei-me a três níveis diferentes: nos padrões citogeográficos in situ e associações ambientais em diferentes complexos poliploides; na interação entre citotipos em zonas de contacto; nas consequências diretas da duplicação do genoma em oposição a adaptações após a poliploidização. Estudos em larga escala para determinar os níveis de ploidia foram realizados ao longo da área de distribuição de Jasione maritima e J. montana, na última com foco maioritário na zona de contacto no noroeste da Península Ibérica, e os requisitos ambientais de cada citotipo foram avaliados. Indivíduos diploides foram reportados pela primeira vez em J. maritima, sendo que os citotipos se encontravam distribuídos alopatricamente: os diploides ocorrem nas dunas do Norte, enquanto os tetraploides estão presentes em populações mais secas e quentes das regiões Centro e Sul da distribuição da espécie. O nicho ambiental mais amplo observado nos tetraploides sugere que a poliploidização pode ter alterado os requisitos ambientais deste citotipo, permitindo a colonização e seu estabelecimento em áreas do Sul e explicando, em parte, o seu atual padrão de distribuição. A distribuição restrita dos diploides revela a necessidade de se desenvolverem medidas de conservação focadas nos citotipos. Em J. montana, os citotipos encontravam-se distribuídos parapatricamente, formando várias zonas de contacto, com os diploides a apresentarem nichos ambientais e geográficos mais amplos que os tetraploides. Neste complexo poliploide, a poliploidização não parece ter causado alterações nas preferências ecológicas dos tetraploides, e por isso é expectável que outros fatores estejam envolvidos nos padrões de distribuição atual. O complexo tetraploide-octoploide Gladiolus communis foi usado para explorar as interações dos citotipos em zonas de contacto, usando um complexo de espécies que possui níveis de ploidia elevados. Primeiro, a diversidade citogenética, os padrões de distribuição e os requisitos ambientais foram explorados. Os citotipos tetraploides e octoploides foram dominantes e, apesar do elevado grau de isolamento, foi igualmente observado que ambos os citotipos crescem em simpatria em várias populações. As exigências ambientais entre citotipos foram similares, sugerindo que a poliploidização não parece ter gerado alterações nas preferências ambientais. A deteção de hexaploides e populações de ploidia mista sugeriram que a hibridização e a formação recorrente de gâmetas não reduzidos são eventos frequentes, o que aponta para recorrente formação de poliploides e fluxo de genes. Consequentemente, a existência de barreiras reprodutivas entre os citotipos que permitam a sua coexistência foram exploradas, em particular, barreiras temporais, comportamentais, mecânicas e gaméticas. Observou-se que as barreiras pré-polinização foram fracas, enquanto que as interações pós-polinização foram fortes e variáveis dependendo das cargas de pólen, refletindo, consequentemente, a estrutura da população. Polinizações controladas sugerem que, após formação, uma menor capacidade excluirá o poliploide da população, a menos que a formação de gâmetas não reduzidos minore esta desvantagem, enquanto que em fases posteriores, as barreiras pós-zigóticas fortes poderão permitir a coexistência dos citotipos. Considerando que a distribuição dos citotipos de J. maritima foi apenas parcialmente explicada pelas variáveis ambientais, foi explorado o papel da poliploidização como motor de diferentes capacidades competitivas entre citotipos. As consequências diretas de duplicações do genoma foram avaliadas usando diploides, neotetraploides e tetraploides estabelecidos, sendo a utilização de neotetraploides uma inovação importante desta Tese. Como não foi possível detetar neotetraploides na natureza, foi estabelecido um protocolo para sintetizar com sucesso neotetraploides em laboratório, usando diferentes tratamentos com colquicina aplicados a diploides naturais. De seguida, diploides, neotetraploides e tetraploides de J. maritima foram cultivados com e sem competição em condições controladas. Os resultados mostraram que a poliploidização não afetou a capacidade competitiva, e por isso, este fator pode não ter desempenhado um papel significativo no estabelecimento dos polipoides. Contudo, capacidades competitivas similares na zona de contacto podem ser responsáveis pela manutenção de uma zona de contacto estável. Além disso, diferentes capacidades competitivas dos citotipos ao longo da área de distribuição de J. maritima, possivelmente ligadas com adaptações a gradientes ambientais, podem ter contribuído para a atual distribuição alopátrica desta espécie. Em conclusão, as consequências da poliploidização foram amplas e variáveis, sendo altamente especificas de cada espécie. Com esta Tese de Doutoramento, observei que a poliploidização pode alterar, parcialmente, os requisitos ambientais das entidades poliploides e ampliar o nicho de cada citotipo, permitindo a colonização de novos habitats. Contudo, isto não foi observado em todos os complexos estudados. De facto, em alguns casos, outros fatores estiveram envolvidos com o estabelecimento e dispersão dos poliploides. As barreiras reprodutivas entre os citotipos foram determinantes nas interações entre citotipos e cruciais para o estabelecimento do novo citotipo nas zonas de contacto. Além disso, as duplicações de genoma levaram a algumas alterações em características de desenvolvimento das plantas, contudo mudanças na capacidade competitiva não foram tão claras, apesar das diferenças existentes entre diploides e tetraploides estabelecidos terem permitido explicar os padrões de distribuição atuais. Os resultados desta Tese de Doutoramento apresentam várias perspetivas futuras no estudo da poliploidia. Claramente, são necessários mais estudos focados nos processos ecológicos, tanto em populações naturais como em condições controladas, de forma a perceber quais as condições responsáveis pelo estabelecimento e dispersão, com sucesso, dos poliploides e, consequentemente, compreender a ocorrência universal da poliploidização nas plantas com flor e o seu papel na evolução e diversificação das plantas