Endothelial Progenitor Cells in Neoangiogenesis of Acute Ischemic Stroke

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Medicina, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraThe treatment of acute ischemic stroke has significantly improved in the last years, with meaningful translation into clinical outcomes. Nonetheless, this evolution has mainly been driven by the development of efficient recanalization therapies that can only benefit a subset of selected patients, leaving the residual lesions deprived of targeted therapies. To address this issue, cell therapies have emerged as potential therapeutic approaches, through the administration of exogenous stem/progenitor cells or the modulation of endogenous cellular populations. An important source of progenitor cells for the treatment of stroke patients are Endothelial Progenitor Cells (EPCs). EPCs are derived from the bone marrow and can be mobilized to ischemic tissues, promoting the development of new vessels. These cells have shown promising effect in preclinical models and observational stroke studies. However, many doubts remain on their exact mechanism of action, integration within stroke pathophysiology and molecular programs. In this project we used a multidisciplinary approach to understand the interplay between EPC activity and microRNA expression, stroke hemodynamics, blood-brain barrier (BBB) permeability and clinical outcome, ultimately aiming to progress in the inclusion of EPC into stroke treatment. We included patients with 18-80 years of age and non-lacunar strokes within the territory of a Middle Cerebral Artery in a prospective longitudinal study. All patients were subject to periodical clinical assessments; magnetic resonance imaging (MRI) at baseline and seven days including quantification of BBB permeability through dynamic contrast enhancement; hemodynamic characterization using ultrasound at baseline, seven days and three months. EPCs of participants were isolated from peripheral venous blood at baseline and seven days and submitted to functional assays. The microRNA of a subset of EPCs (CD34+ cells) at admission were sequenced and analysed compared to clinical and neuroimaging data. Clinical outcome was defined according to the modified Rankin scale at three months. The study population consisted of 45 patients, with a median age of 70.0 years (IQR: 10.0). Our results indicated that the functional properties of EPCs are associated with subacute BBB permeability, development of collateral circulation, subacute cerebral blood flow and clinical outcome. These associations were more evident at seven days than the first 24 hours. Genetic sequencing identified 24 miRNAs of CD34+ associated with good outcome, with a common effect on adherens junction pathway. These results established the positive association of EPCs with the angiogenic response after stroke, thus supporting the design of a randomized phase IIa trial to assess the efficacy of CD34+ cells in acute ischemic stroke. In conclusion, the results obtained in this thesis indicate that EPCs have a substantial role in the pathophysiology of stroke, being associated with improved clinical outcomes and thus warranting their translation into randomized explanatory trials.O tratamento do Acidente Vascular Cerebral isquémico agudo evoluiu significativamente nos últimos anos, com tradução na melhoria de resultados clínicos. No entanto, esta progressão deveu-se essencialmente ao desenvolvimento de estratégias eficazes de recanalização, que conseguem beneficiar apenas um subgrupo de doentes selecionados, deixando a lesão residual sem medicação dirigida. Este vazio terapêutico impulsionou o estudo de terapias celulares, pela administração exógena de células progenitoras/estaminais ou pela modulação de populações celulares endógenas. Uma fonte importante de células progenitoras para o tratamento de AVC isquémico são as Células Progenitoras Endoteliais (EPC). EPCs são células derivadas da medula óssea com a capacidade de serem mobilizadas para tecidos isquémicos promovendo a formação de novos vasos. Modelos pré-clínicos e estudos observacionais afirmaram o seu potencial efeito positivo, contudo persistem dúvidas sobre o seu exato mecanismo de ação, integração na fisiopatologia cerebrovascular e programas moleculares. Neste projeto utilizámos uma abordagem multidisciplinar para perceber a interação entre EPCs e sua expressão de microRNA com hemodinâmica vascular, permeabilidade da barreira hemato-encefálica e resultado clínico, procurando a integração de EPCs no tratamento do Acidente Vascular Cerebral. Incluímos doentes entre 18 e 80 anos de idade com Acidente Vascular Cerebral não lacunar no território de uma Artéria Cerebral Média num estudo longitudinal prospetivo. Todos os doentes foram submetidos a avaliações clínicas periódicas; Ressonância Magnética nas primeiras 24 horas e aos sete dias incluindo quantificação da permeabilidade da Barreira Hemato-Encefálica por “Dynamic Contrast Enhancement”; caracterização hemodinâmica por técnicas ultrassonográficas nas primeiras 24 horas, sete dias e três meses. As EPCs dos participantes foram isoladas a partir de sangue venoso periférico com avaliação posterior das suas capacidades funcionais. Os microRNA das células CD34+ na admissão foram sequenciados, comparando com dados clínicos e neuroimagiológicos. O resultado clínico foi definido pela escala modificada de Rankin aos três meses. A população de estudo incluiu 45 doentes com idade mediana de 70.0 anos (IQR: 10.0). Os nossos resultados indicaram que as capacidades funcionais das EPCs estão associadas à permeabilidade da Barreira Hemato-Encefálica e fluxo sanguíneo cerebral em fase subaguda, circulação colateral e resultado clínico. Estas associações foram mais evidentes sete dias após a instalação sintomática. A sequenciação genética das células CD34+ identificou 24 microRNAs associados a bom resultado clínico, partilhando a modulação da via das junções adherens. Estes resultados permitiram estabelecer a associação positiva entre EPCs e o desenvolvimento de neoangiogénese após Acidente Vascular Cerebral isquémico, servindo de suporte ao desenho de um ensaio randomizado de fase IIa para avaliar a eficácia das células CD34+.Harvard Medical School-Portugal program: 2012 research awardGabinete de Apoio à Investigação da Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraANIFC – Associação Nacional de Imagiologia Funcional Cerebral: apoio à investigação em Neuro-imagem 2011Novartis Farma, Research grantTeva Neuroscience, Research gran