Die Regulation der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase in der normalen und der chronisch-diabetischen kutanen Wundsituation

Die kutane Wundheilung hat die funktionelle Wiederherstellung der Gewebeintegrität nach Schädigung zum Ziel. Sie erfolgt im Sinne einer gesteuerten Kaskade von sequentiellen Ereignissen. Diese umfassen die Hämostase, die Inflammation, die Granulation, die Reepithelialisierung und das Remodeling. Die zugrundeliegenden Prozesse werden von einer Vielzahl proinflammatorischer Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Neben diesen Proteinmediatoren ist eine Beteiligung löslicher Kleinmoleküle, wie dem Stickstoffmonoxid (NO), für die Regulation der Wundheilung bekannt. NO ist ein flüchtiges Radikal, welches enzymatisch durch die Isoformen der Stickstoffmonoxidsynthasen (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin synthetisiert wird. NO entfaltet ein breites Spektrum physiologischer und pathophysiologischer Effekte. Dabei ist für die induzierbare NOS (iNOS) eine relevante Beteiligung an epithelialen Prozessen hinreichend dokumentiert. FRANK et al. [1998] konnten eine starke Induktion der iNOS während der kutanen Wundheilung sowie einen funktionellen Zusammenhang zu den NO-Wirkungen auf Keratinozyten zeigen, die in Verbindung mit der enzymatischen Funktion der iNOS stehen. Eine gestörte kutane Wundheilung wurde auch für Mäuse mit Defizienz der endothelialen NOS (eNOS) beschrieben. Die Beteiligung der eNOS an der Wundheilung war bislang jedoch weitgehend unklar. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Expressionsmuster der eNOS im Wundheilungsverlauf in gesunden und diabetischen Mäusen aufzuzeigen. In einem kutanen Wundheilungsmodell in Mäusen konnte die Expression von eNOS mRNA und Protein gezeigt werden. Die Expressionskinetik zeigte eine moderate Induktion der eNOS in den frühen Wundheilungsphasen. Diese ließ sich nicht mit einer endothelialen Expressionsänderung erklären, wie es Untersuchungen mit CD31 als pan-endothelialem Marker nahe legten. Immunhistochemisch konnten Gefäßendothelien des Granulationsgewebes, Keratinozyten der Wundränder, das sich ausbildende Neo-Epithel und Haarfollikel als zusätzliche Quellen der eNOS Proteinexpression in Wunden identifiziert werden. Die eNOS Färbung zeigte sich dabei begrenzt auf die suprabasal gelegenen Keratinozyten der benannten Epithelien. Die Expression der eNOS in Keratinozyten konnte schließlich auch in kultivierten primären humanen Keratinozyten und HaCaT Keratinozyten auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Darüber hinaus zeigte sich ein funktioneller Zusammenhang zwischen eNOS Expression und epithelialer Proliferation: So bildeten eNOS-defiziente Mäuse deutlich reduzierte Wundrandepithelien aus, die durch eine verminderte Proliferation der Keratinozyten charakterisiert waren. Untersuchungen an diabetischen Mäusen (db/db) stützten diesen funktionellen Zusammenhang. In den Expressionskinetiken in diabetischen Tieren zeigte sich eine deutlich reduzierte Expression von eNOS mRNA und Protein vor allem in den späten Wundheilungsphasen. In der vorliegenden Arbeit werden die zeitliche Expression der eNOS, die Detektion der eNOS in Wunden sowie deren Alteration in diabetischen Mäusen mit Bezug auf ihre funktionelle Bedeutung in der kutanen Wundheilung abschließend diskutiert.Cutaneous wound repair aims for the functional recovery and integrity of damaged tissue after injury. Skin repair represents a coordinated sequential cascade of events. These embrace blood clot formation, inflammation, granulation tissue formation, neo-epithelialization, and a remodeling phase of repair. The underlying processes are driven by an increasing number of pro-inflammatory cytokines and growth factors. These proteinaceous, tissue-active factors are not unique in driving wound repair, as evidence is present for the action of small diffusible molecules such as nitric oxide (NO) for healing. NO is a free gaseous radical, which is produced from the amino acid L-arginine by a family of three distinct isoforms of nitric oxide synthases (NOS). Nitric oxide provides a broad spectrum of physiological and pathophysiological properties. An important role of inducible NOS (iNOS) for epithelial action during skin repair has been well established. FRANK et al [1998] observed a large induction of iNOS upon skin injury and functionally connected NO actions to keratinocyte biology. These processes were connected to iNOS enzymatic function. Although a delayed healing of skin wounds has been formerly described for endothelial NOS (eNOS)-deficient mice, a participation of eNOS in skin repair largely remains unclear. This study was established to analyze expression patterns of eNOS during wound healing in healthy and in diabetic mice. Based on an established wound healing model in mice, the presence of eNOS mRNA and protein could be demonstrated in healthy mice using several controls. Expression pattern in normal healing was characterized by a moderate induction of its eNOS mRNA and protein levels in the early stages of repair. Interestingly, using CD31 as a pan-endothelial marker, eNOS protein elevation could be demonstrated to be most likely not due to an endothelial-derived expression. Immunohistochemistry revealed the endothelial lining of blood vessels within the granulation tissue, and also keratinocytes of the wound margins, the developing neo-epithelium, and the hair follicles to express eNOS protein. Remarkably, eNOS staining was restricted to the suprabasal keratinocytes of the abovemented epithelia. Keratinocyte-derived expression of eNOS could be confirmed at the mRNA level in vitro for human primary keratinocytes and the keratinocyte cell line HaCaT. Furthermore, eNOS enzymatic activity is associated with epithelial proliferation, as eNOS-deficient animals exhibited reduced wound margin epithelia associated with reduced keratinocyte proliferation. Moreover, observations in genetically diabetic mice (db/db) supported a functional role of eNOS in healthy animals. These time-course studies in diabetic animals revealed a disturbed eNOS mRNA expression with a decline below control skin level in the late stages of repair. Diabetes-impaired healing was associated with a clearly reduced eNOS protein expression as well. In summary, spatial and temporal expression patterns of eNOS and its alteration in diabetic wound healing are discussed in this study with respect to its functional role in wound healing