Evaluación ecotoxicológica de metales sobre macrófitas acuáticas

Los ecosistemas acuáticos son los receptores tanto de materia orgánica como de diferentes compuestos artificiales de origen industrial, agrícola y de desecho, provenientes de los ecosistemas terrestres. Las actividades antrópicas generan residuos que contienen sustancias químicas de diversa naturaleza capaces de afectar tanto a los organismos acuáticos como la salud humana, ya que resultan en una mezcla compleja de sustancias orgánicas e inorgánicas, compuestos persistentes y bioacumulables. Los metales son componentes inorgánicos persistentes que forman parte de las aguas residuales generadas por actividades industriales químicas, textiles, galvanoplásticas, cromados, metalúrgicas, papeleras y también por el tratamiento de residuos domésticos, introduciéndose al ambiente en forma de mezclas. Una vez en los sistemas, quedan disponibles en los sedimentos, en la columna de agua o en la materia en suspensión, donde rápidamente son tomados por los organismos residentes, entre ellos los productores primarios. Las macrófitas acuáticas o hidrófitas, constituyen un nivel trófico esencial ya que proveen la energía básica para las redes alimentarias, cumpliendo una importante función en la incorporación y asimilación de nutrientes y energía al ciclo del ecosistema, la oxigenación de las aguas, la estabilización de los sedimentos y proveen de hábitat para una variedad de organismos acuáticos, tanto invertebrados como vertebrados. Los cambios en la dinámica de la comunidad de las hidrófitas de un ecosistema afectarán las comunidades de micro, macroinvertebrados y peces, afectando así todo el ecosistema. Las macrófitas acuáticas resultan fundamentales en la estructura, función y mantenimiento de las características físicas y químicas de los ecosistemas acuáticos, por lo tanto, es sumamente necesario el desarrollo de herramientas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias inorgánicas persistentes como los metales. Para una evaluación ecotoxicológica integrada se deben incluir una gama de variables de respuestas que incluyan, el análisis de procesos como el crecimiento, caracteres morfológicos, y también biomarcadores de naturaleza enzimática que actúen sobre moléculas señales que desencadenan diferentes procesos de defensa.El objetivo del presente trabajo fue realizar una contribución en el desarrollo de herramientas para la evaluación de los efectos tóxicos de elementos metálicos en sistemas biológicos acuáticos, con el fin de ampliar el conocimiento para el diagnóstico ecotoxicológico en plantas vasculares. Los metales estudiados fueron Zinc (Zn), Níquel (Ni) y Cadmio (Cd), los cuales constituyen los principales metales liberados al ambiente por vía antrópica, evidenciado por poseer los mayores valores de tasa de enriquecimiento antrópico (TEA), respecto a sus valores naturales. Las macrófitas acuáticas estudiadas corresponden a especies flotantes y sumergidas en la columna de agua, Lemna gibba (familia Lemnaceae) y Ceratophyllum demersum (familia Ceratophyllaceae), respectivamente. Se llevaron a cabo evaluaciones ecotoxicológicas con ambas especies. Para L. gibba se estudió la acción sobre sobre distintos parámetros de crecimiento como número de frondes, peso fresco y área total. También se determinaron parámetros morfométricos como son las longitudes de los ejes transversales y longitudinales. Además se evaluaron parámetros bioquímicos como pigmentos (clorofila ?a?, clorofila ?b? y total de carotenoides), contenido de proteína soluble total y la actividad de enzimas antioxidantes (catalasa, ascorbato peroxidasa y guaiacol peroxidasa). Los resultados obtenidos en los estudios realizados con L gibba, permitieron concluir que el metal más tóxico basándose en el peso fresco resultó ser el Cd, mientras que si se consideran el área total y el número de frondes, las plantas fueron más sensibles al Ni. Para los tres parámetros de crecimiento evaluados, las plantas resultaron menos sensibles al Zn. Se pudo evidenciar un efecto fitotóxico por parte de los tres metales evaluados individualmente, manifestado por una inhibición del crecimiento cuando se analizó en base las distintas variables de medida y observándose una estimulación del crecimiento para Ni y Zn en las menores concentraciones evaluadas. Como parámetro de evaluación del nivel de desagregación de las plantas, se calcularon las relaciones frondes/colonias para cada metal. Este índice resultó ser más afectado por el Cd. Los tratamientos con los tres metales afectaron en general negativamente el contenido de proteína y de los diferentes pigmentos evaluados, donde solo se observó un pequeño incremento no significativo en las plantas expuestas a Cd para el contenido de clorofila ?b? y carotenoides. En cuanto a las actividades enzimáticas se observó en general un incremento de las mismas como resultado de las exposiciones a los distintos metales en bajas concentraciones. Particularmente la GPOX y APOX fueron las que mayor actividad mostraron y las que incrementaron mayormente su actividad respecto de los controles. Además de los ensayos con metales individuales se evaluaron la toxicidad de mezclas binarias y trinarias. Dentro de las primeras, se estudió la acción sobre los parámetros de crecimiento número de fronde y peso fresco, así como los bioquimicos de contenido proteico y actividad enzimatica. Se evaluaron las interacciones por pares de los mismos metales Ni, Zn y Cd. Se evidenció una gran toxicidad en las diferentes combinaciones de concentraciones para las tres mezclas binarias en base a las distintas variables de respuesta obtenidas. El contenido proteico fue afectado negativamente por los tratamientos en las tres mezclas. Se observó además, un efecto sobre la actividad de las distintas enzimas. La relación frondes/colonias resultó más afectada que para el caso de los metales individuales, siendo el efecto tóxico un poco mayor para la mezcla Cd/Zn. El análisis de la interacción de las mezclas binarias de los metales sobre L. gibba, permitió definir a la mezcla Ni/Zn como aditiva, la mezcla Cd/Zn como sinérgica, mientras que la mezcla Cd/Ni resultó antagónica. En los estudios de los efectos de la toxicidad de mezclas trinarias, se evaluaron los parámetros de crecimiento número de frondes y la longitud de las raíces. Se realizaron dos experiencias diferentes con concentraciones ambientales, cada una de las cuales con la presencia de diferentes concentraciones de carbóno orgánico disuelto (COD) en el medio de cultivo (0.5 y 10 mg COD/L). Luego del período de exposición, se realizó una determinación del contenido de los metales en tejido. Se observó una elevada toxicidad por parte de todas la combinaciones bajo la presencia de ambas concentraciones de COD. En particular el crecimiento de las raices resultó ser más severamente afectado que el número de frondes, indicando que en estos casos resultaría un parámetro más sensible. La concentración interna fue mayor en los tratamientos individuales que en las mezclas para Cd, Ni y Zn bajo ambas concentraciones de COD. En las mezclas trinarias, el Cd resultó ser el metal que más rápidamente fue incorporado en el tejido vegetal y en mayor concentración, contrariamente a lo observado en las experiencias individuales. Se utilizó el concepto de UT para evaluar si el modelo aceptado a priori de Concentración Aditiva (CA), basado en la concentración interna, resulta en un mejor predictor de la toxicidad de la mezcla Cd-Ni-Zn en la planta acuática Lemna gibba, que la comúnmente utilizada concentración disuelta. En todos los casos se obtuvieron ∑UT promedio mayores a la unidad, y en general no se observaron valores más cercanos a la unidad al considerar la concentración interna como la dosis de exposición. Por lo tanto la toxicidad de dicha mezcla de metales, no estuvo más cerca de la aditividad por considerar la concentración en tejido que cuando se consideró la concentración externa en solución.Para las evaluaciones ecotoxicológicas con Ceratophyllum demersum, se determinaron distintos parámetros de crecimiento como el peso fresco, la longitud del tallo principal y la longitud total. Además se determinaron parámetros bioquimicos como contenido de proteína total soluble y la actividad enzimaticas de la catalasa, ascorbato peroxidasa y guaiacol peroxidasa. Los estudios realizados sobre la acción de los metales Zn Ni y Cd en forma individual sobre Ceratophyllum demersum, permitieron concluir que el Cd resultó el metal más tóxico para esta especie. En este caso, las plantas expuestas a este metal presentaron clorosis y disgregación de las hojas. Por otra parte, el peso fresco fue el parámetro más sensible, de todos los parámetros evaluados para describir la acción de los metales. La actividad de las enzimas del estrés oxidativo permitió detectar efectos subletales de los metales sobre esta especie, principalmente las enzimas APOX y GPOX. De esta manera estos biomarcadores permiten la detección temprana de efectos, como lo observado en los estudios realizados con L gibba. Se encontraron diferencias de sensibilidad entre las macrófitas evaluadas, ya que el metal menos tóxico resultó el Zn para ambas, pero L. gibba presentó más tolerancia. El Cd resultó ser el metal más tóxico para ambas especies, siendo C. demersum más sensible que L. gibba. El Ni resultó más tóxico para L. gibba, presentando mayor tolerancia C. demersum. Se realizaron ensayos de bioacumulación de metales individuales con C. demersum hallando las cinéticas de incorporación para los tres metales, representadas correctamente por el modelo Michaelis-Menten, donde se observó una mayor capacidad máxima de acumulación para el Zn, mientras que el Cd fue el acumulado en menor concentración.Se implementó un sistema multiespecífico (L. gibba, Spirodela sp. y C. demersum) y multimetal (Ni, Zn y Cd en forma simultánea) a fin de explorar la potencialidad del uso de estas macrófitas en fitoremediación. Los resultados permitieron concluir que el sistema resultó altamente eficiente, ya que la ecotoxicidad del efluente artificial al final del proceso de fitoremediación se redujo en un 80%, validado mediante ensayos de ecotoxicidad con Cladóceros y microalgas.La evaluación ecotoxicológica de metales sobre macrófitas que contemplen distintas variables de respuestas como crecimiento y biomarcadores enzimáticos, resulta esencial para la preservación y conservación de los ecosistemas acuáticos, ya que los mismos en forma individual o en mezclas producen efectos adversos. El conocimiento de los mecanismos involucrados en la toxicidad y tolerancia a los metales puede ser utilizado en tecnologías de fitoremediación de aguas residuales y efluentes industriales.Aquatic ecosystems are receptors of organic matter and different anthropogenic compounds from industrial, agricultural and waste origin coming from terrestrial ecosystems. Anthropogenic activities generate waste containing chemical substances of different nature capable to affect both aquatic organisms and human health, as they result in complex organic and inorganic substances mixtures, bioaccumulative and persistent compounds. Heavy metals are inorganic persistent components that are part of wastewaters generated by chemical, textile, electroplating, chromed, metallurgical and paper industries and also by the treatment of domestic waste, being introduced in environment as mixtures. Once in the systems, are available in sediments, water column or in suspended matter, where rapidly are taken by resident organisms, including primary producers. Aquatic macrophytes or hydrophytes, establish an essential trophic level as they provide much of the basic energy for the food network, developing an important function in the incorporation and assimilation of nutrients and energy to the cycle of the ecosystem, water oxygenation, sediment stabilization and providing habitat and shelter to a variety of aquatic organisms both invertebrates and vertebrates. Changes in hydrophytes community dynamics would affect micro and macroinvertebrates and fishes, influencing the entire ecosystem. Aquatic macrophytes are key components in structure, function and maintenance of physical and chemical characteristics of aquatic ecosystems, then, is extremely necessary developing tools for ecotoxicological assessment of persistent inorganic substances like metals. For an integrated ecotoxicological evaluation, it should be incorporated a range of response variables that include the analysis of processes such as growth, morphometric characters and also enzymatic biomarkers which act over signaling molecules that trigger different defense processes. The aim of the present work was to realize a contribution in the developing of tools for toxic effects assessment of metallic elements in biological aquatic systems, with the goal of expanding knowledge for ecotoxicological diagnosis in vascular plants. The studied metals where Zinc (Zn), Nickel (Ni) and Cadmium (Cd), which are some of the main metals released into environment by anthropic way, showed by presenting the highest anthropogenic enrichment rate respect natural values. The studied aquatic macrophytes are floating or submerged species in the water column, Lemna gibba (Lemnaceae family) and Ceratophyllum demersum (Ceratophyllaceae family), respectively. Ecotoxicological assessment was carried out with both species. For Lemna gibba, the action on different parameters of growth such as frond number, fresh weight and total area were studied. Also, the morphometric parameters such as transversal and longitudinal axes length were determined. Besides, biochemical parameters such as pigments (chlorophyll “a”, chlorophyll “b” and total carotenoids), total protein content and activity of antioxidant enzymes (catalase, ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase). Results obtained from studies with L. gibba, allowed to conclude that the most toxic metal based in fresh weight was Cd, while plants were more sensitive to Ni when total area and frond number were considered. For the three evaluated growth parameters, plants resulted less sensitive to Zn. A phytotoxic effect by the individual metals was observed, revealed by a growth inhibition when it was analyzed based on the different measurement variables and also was showed a stimulatory effect in growth for the lowest assessed concentration of Ni and Zn. As a disaggregation degree parameter in plants, frond/colony ratio was calculated for each metal. This index resulted more affected by Cd. Treatments with three metal generally affected in a negative way the protein and pigment content, where only a little rise in chlorophyll “b” and carotenoids was observed in plants exposed to Cd. Regarding to enzymatic activities, in general a rise was observed as a result from exposures to low concentrations of metals. Particularly, GPOX and APOX were the ones that showed highest activity and a mayor increase respect controls. Besides individual assessment, toxicity of binary and trinary mixtures was evaluated. For binary mixtures, the effect over the growth parameters frond number and fresh weight was studied, as well as the biochemical ones protein content and enzymatic activity. The interactions by pairs of the metals Ni, Cd and Zn were evaluated. A high toxicity of the different combinations of concentrations for the three binary mixtures based on obtained different response variables was evidenced. Protein content was negatively affected by treatments in the three mixtures. Moreover, it was observed an effect over the different enzymes activity. The frond/colony ratio was more affected than for the case of single metals, being the toxic effect slightly higher for Cd/Zn mixture. The interaction analysis of metals binary mixtures over L. gibba, showed that Ni/Zn mixture can be defined as additive, Cd/Zn mixture as synergic, while Cd/Ni resulted antagonist. In the toxicity effects studies of trinary mixtures, the growth parameters frond number and root length were evaluated. Two separated assays with environmental concentrations of metal were carried out, each one with the presence of 0.5 or 10 mg/L of dissolved organic carbon (DOC) in the culture medium. After exposure period, a tissue metal content determination was realized. A high toxicity of all combinations under both DOC concentrations was observed. Particularly, the root growth resulted more severely affected that frond number, indicating that in these cases would result in a more sensitive parameter. Internal concentration was higher in single treatments than in mixtures for Cd, Ni and Zn for both DOC concentrations. In trinary mixtures, Cd was the more rapid incorporated metal in plant tissue and in higher concentration, contrary to what was observed in single exposures. Toxic Units (TU) concept was used to evaluate if the a priori accepted model of Concentration Addition (CA), based in internal concentration, results in a better predictor of the toxicity of the Cd-Ni-Zn mixture in the aquatic plant Lemna gibba, than the commonly used dissolved concentration. In all cases the average ∑TU obtained were greater than unity, and in general closer values to unity were not observed by considering internal concentration as exposure dose. Therefore, the toxicity of trinary mixtures was not closer to additivity by considering tissue concentration than when external in solution was considered. For the ecotoxicological assessments with Ceratophyllum demersum, different growth parameters such as fresh weight, main shoot length and total length were determined. Additionally, biochemical parameters such as protein content and enzymatic activity of catalase, ascorbato peroxidase and guiacol peroxidase were determined. The studies over the effects of Zn, Ni and Cd as single metals on Ceratophyllum demersum, showed that Cd resulted in the most toxic one for this specie. Plants exposed to this metal showed chlorosis and disintegration of leaves. The fresh weight was the most sensitive parameter from all evaluated for describing the action of metals. Oxidative stress-related enzymes activity allowed detecting sublethal effects of these metals over this specie, mainly APOX and GPOX enzymes. Thus, these biomarkers allow the early detection of effects, like the observed in the studies with L. gibba. Different sensitivities between evaluated macrophytes were found, since the less toxic metal for both species was Zn, but L. gibba being more tolerant. Cd resulted in the most toxic for both species, being C. demersum more sensitive than L. gibba. Ni resulted more toxic for L. gibba, being C. demersum more tolerant for this metal. Bioaccumulation assays were performed for single metals with C. demersum finding the incorporation kinetics for the three metals, correctly characterized by Michaelis-Menten model, were a higher maximum accumulation capacity was observed for Zn, while Cd was accumulated in less extent. A multispecific system (L. gibba, Spirodela sp. and C. demersum) and multimetal (Ni, Zn and Cd) was performed in order to explore the potentiality for the use of these macrophytes in phytoremediation. Results allow to conclude that the system was highly efficient, since the artificial effluent ecotoxicity was reduced a 80% at the end of the phytoremediation process, validated by ecotoxicity assays with cladoseran and microalgae. The ecotoxicological assessment of metals over macrophytes contemplating different response variables like growth and enzymatic biomarkers results essential in preservation and conservation of aquatic ecosystems, because these produce adverse effects as single or mixture exposures. The knowledge of involved mechanisms in toxicity and tolerance to metals could be used in phytoremediation technologies for wastewaters and industrial effluentsFil: Martinez, Ricardo Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo; Argentin