Identification of new phaeochromocytoma and paraganglioma susceptibility genes

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 29-05-2019Los feocromocitomas y paragangliomas (PPGLs) son tumores derivados de la cresta neural que se desarrollan a partir de las células cromafines de la médula adrenal (PCC) o de los paraganglios ubicados en la cabeza y cuello, abdomen y tórax (PGL). Aproximadamente un 75% de los PPGLs porta mutaciones mutuamente excluyentes, bien germinales (~40%) o somáticas (~30%), en al menos uno de 17 genes de susceptibilidad. El alto porcentaje de pacientes en el cual se ha identificado mutaciones germinales ha convertido a los PPGLs en los tumores humanos más hereditarios. Sin embargo, aún quedan casos de PPGLs con signos clínicos de heredabilidad, tales como tumores múltiples, edad temprana de aparición o historia familiar de la enfermedad, que no han sido diagnosticados genéticamente. Por ello, el objetivo primordial de esta tesis fue la identificación de nuevos genes de susceptibilidad a desarrollar PPGL en pacientes sin mutaciones en los principales genes identificados hasta la fecha. En el primer proyecto, se aplicó un panel de secuenciación exómica dirigida que incluía genes relacionados con el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) a una serie seleccionada de PPGLs hipermetilados. De esta forma, se pudieron identificar mutaciones somáticas en genes de susceptibilidad ya conocidos, como IDH1 y SDHC, así como alteraciones germinales en dos genes nuevos, GOT2 e IDH3B. Este estudio permitió enfatizar la relevancia del ciclo TCA en el desarrollo de PPGL, así como la participación de otras enzimas con funciones de intercambio metabólico entre la mitocondria y el citosol. Entre los tumores seleccionados en el primer proyecto y sin mutaciones en ninguno de los genes incluidos en el panel, se encontraba el de una paciente joven con múltiples PGLs pero sin historia familiar de la enfermedad. En el segundo proyecto, se llevó a cabo la secuenciación germinal del exoma completo de un trio probando-padres, descubriéndose así una mutación de novo activadora en el gen DNMT3A (c.896A>T, p.Lys299Ile). La presencia de un fenotipo metilador en diversos tejidos mutados, la identificación de mutaciones somáticas subclonales en seis PGLs adicionales y el descubrimiento de una segunda mutación germinal (c.952C>T, p.Arg318Trp) en una paciente con historia familiar de PPGL, respaldaron el rol patogénico de las alteraciones en DNMT3A. Finalmente, tras ampliar la serie de pacientes analizados con el panel de genes relacionados con el ciclo TCA, identificamos cinco variantes germinales diferentes en el gen DLST en siete pacientes no relacionados con PPGL. Se pudo demostrar que una mutación heterocigota recurrente en DLST (c.1121G>A, p.Gly374Glu), hallada en cuatro pacientes diferentes, confería susceptibilidad a desarrollar PPGL múltiple. La ausencia de proteína DLST salvaje tanto en tumores como en células DLST-KO interrumpía la actividad del complejo OGDH, desencadenando la acumulación de metabolitos y un perfil homogéneo tanto de expresión como de metilación en los tumores con mutación en DLST.Phaeochromocytomas and paragangliomas (PPGLs) are neural crest-derived tumours that arise from the chromaffin cells of the adrenal medulla (PCC) or from the paraganglia of the head and neck, abdominal or thoracic regions (PGL). Approximately 75% of PPGLs carry mutually exclusive germline (~40%) or somatic (~30%) mutations affecting one of at least 17 major susceptibility genes. The high percentage of patients for which germline mutations have been found has turned PPGLs into the most heritable of all human tumours. However, there are still PPGL cases with clinical signs of heritability, such as multiple tumours, early age at onset or family history of the disease, that are genetically undiagnosed. Therefore, the principal aim of this thesis was the identification of new PPGL susceptibility genes in patients without mutations in any of the main driver genes identified so far. In the first project, a targeted exome sequencing panel of tricarboxylic acid (TCA) cycle-related genes was applied to a selected series of hypermethylated PPGLs. In this way, it was possible to identify somatic mutations in already known PPGL susceptibility genes such as IDH1 and SDHC, as well as germline alterations in two new genes, GOT2 and IDH3B. This study further highlighted both the relevance of the TCA cycle in PPGL development, as well as the involvement of other metabolic enzymes with a role in metabolite exchange between the mitochondria and the cytosol. Among the tumours selected in the first project without mutations in any of the genes included in the panel, there was one from a young patient with multiple PGLs but without family history of the disease. In the second project, whole-exome germline sequencing was applied to a parents-proband trio, uncovering a de novo germline gain-of-function mutation in the DNMT3A gene (c.896A>T, p.Lys299Ile). The presence of a methylator phenotype in several mutated tissues, the identification of subclonal somatic mutations in six additional PGLs and the finding of a second DNMT3A germline mutation (c.952C>T, p.Arg318Trp) in a patient with family history of PPGL, further supported the pathogenic role of alterations in this gene. Finally, upon extension of the series of patients analysed with the TCA cycle-related genes panel, we identified five different germline DLST variants in seven unrelated PPGL patients. We demonstrated that a recurrent heterozygous DLST mutation (c.1121G>A, p.Gly374Glu) found in four different patients, conferred susceptibility to develop multiple PPGL. The absence of wild-type DLST both in tumours (by germline mutation and loss of heterozygosity due to uniparental disomy) and in DLST-KO cells, disrupted the activity of the OGDH complex, triggering the accumulation of metabolites and leading to a homogeneous expression and methylation profile in DLST-mutated tumours.Los siguientes proyectos han permitido la realización de esta Tesis Doctoral: • Proyecto PI12/00236 de la Federación Española de Enfermedades Raras (FEDER) dirigido por el Dr. Alberto Cascón Soriano. Periodo: 2016-2017. • Proyecto FP7/2007-2013 de European Network for the Study of Adrenal Tumors (ENS@T)- Seventh Framework Programme dirigido por la Dra. Mercedes Robledo Batanero. 2017. • Proyecto PI14/00240 de la Federación Española de Enfermedades Raras (FEDER) dirigido por la Dra. Mercedes Robledo Batanero. 2018