Patient-derived normal and tumor colorectal organoids: Studies on gene expression, vitamin D and drug activity

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 12-04-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 12-10-2020Colon/colorectal cancer (CRC) is the most frequent neoplasia in Spain (both genders), a leading cause of cancer-related deaths worldwide and the cancer most associated to vitamin D deficiency in epidemiological studies. Previous mechanistic studies have shown a variety of effects of the active vitamin D metabolite, 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 (calcitriol), on human colon carcinoma cells and, recently, on stromal fibroblasts. This Thesis constitutes the first study on the action of calcitriol on human colon and rectum stem cells, both normal and tumoral. Results obtained show that the high affinity vitamin D receptor (VDR) is expressed by a large proportion of human colon stem cells (LGR5+) located at the crypt bottom in healthy tissue, as well as by organoids generated by these cells and by those derived from colon tumors. In both types of organoids, calcitriol inhibits cell proliferation without affecting clonogenicity. In normal colon organoids, RNA-sequencing analysis have led to the identification of a high number of genes regulated by calcitriol including some involved in stemness (LGR5, MSI1, SMOC2,...), proliferation control (LRIG1...) and other cell functions. Chromatin immunoprecipitation-sequencing studies have led to the identification of genes that contain VDR binding sites in or close to their promoters and so, are candidate direct transcriptional calcitriol targets. In tumor organoids, calcitriol also regulates a wide array of genes, which partially overlap with those in normal organoids. Contrarily to normal organoids, calcitriol targets in colon tumor organoids include differentiation genes but only few genes related to stemness. In line with these findings, ultrastructural analyses by electron microscopy show that calcitriol does not alter the undifferentiated cell phenotype in normal colon organoids but, instead, it induces differentiation features in tumor organoid cells. Altogether, this pioneering study demonstrates that calcitriol distinctly regulates the phenotype of human colon normal and cancer stem cells. Our results show also that human (left-side) colon and rectum normal organoids have very similar patterns of gene expression, and that, accordingly, calcitriol has comparable effects in the types of organoids. Finally, we have set up an assay for antitumor drugs using patient-derived colon tumor organoids that may be useful for personalized medicine of CRC patients and for the analysis of the activity of new compounds.El cáncer de colon/colorrectal (CCR) es la neoplasia más frecuente en España (ambos sexos), una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo y el cáncer más asociado a la deficiencia de vitamina D en los estudios epidemiológicos. Estudios previos han revelado efectos protectores del metabolito activo de la vitamina D, la 1a,25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol) en células de carcinoma de colon humano y, recientemente, en fibroblastos estromales. Los organoides son estructuras 3D in vitro derivadas de células troncales/stem que reproducen parcialmente la organización tisular y permiten el estudio de procesos biológicos. Esta Tesis constituye el primer estudio sobre la acción del calcitriol en organoides normales y tumorales derivados de muestras de pacientes con CRC. Los resultados muestran que el receptor de vitamina D (VDR) se expresa tanto en las células troncales del tejido colónico humano sano como en organoides generados a partir de estas células, y también en organoides derivados de algunos tumores de colon. En ambos organoides, normales y tumorales, el calcitriol inhibe la proliferación celular sin afectar la clonogenicidad. En los organoides normales, análisis transcriptómicos globales (RNA-seq) han identificado genes regulados por calcitriol, algunos implicados en el aumento de troncalidad/stemness, control de la proliferación y otras funciones. Los estudios de inmunoprecipitación de cromatina acoplada a secuenciación (ChIP-seq) han permitido identificar genes con sitios de unión de VDR estimulados por calcitriol, probables dianas directas de la vitamina D. En organoides tumorales el calcitriol regula también un amplio conjunto de genes, algunos coincidentes con los identificados en organoides normales (escasos relacionados con stemness) y otros específicos, entre ellos genes de diferenciación. En línea con estos datos, análisis mediante microscopía electrónica muestran que el calcitriol no altera el fenotipo de células indiferenciadas en los organoides normales de colon, y, por el contrario, induce diferenciación celular en organoides tumorales. Este estudio pionero demuestra que el calcitriol regula de modo diferencial el fenotipo de las células troncales/stem normales y tumorales de colon humano. Estudios comparativos han mostrado que los organoides normales derivados de tejido sano de colon y recto tienen patrones de expresión génica casi idénticos. De acuerdo con ello, el calcitriol tiene efectos similares en ambos tipos de organoides. Organoides tumorales derivados de colon y recto tienen perfiles transcriptómicos más heterogéneos, si bien su respuesta a calcitriol es muy similar. Finalmente, hemos puesto a punto un ensayo de drogas antitumorales utilizando organoides tumorales de colon derivados de pacientes con CCR, que ha permitido confirmar la utilidad de este sistema en medicina de precisión/personalizada y para el estudio de nuevas moléculas