Structure-function analysis of human PrimPol

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-04-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 24-10-2020PrimPol es la segunda primasa en células humanas, la primera con la capacidad de iniciar la síntesis de cadenas de DNA con dNTP. PrimPol contribuye a la tolerancia al daño del DNA reiniciando su síntesis más allá de la lesión, actuando como una TLS primasa, saltando lesiones ilegibles como sitios abásicos, o "leyendo" ciertas lesiones como 8-oxo-dG. PrimPol contiene un core de Primasas Arqueo-Eucariotas (AEP) seguido de un dominio que contiene un dedo de Zinc (ZnFD) en la región C-terminal, que es requerido exclusivamente para la formación de iniciadores y para la función PrimPol in vivo. La presente tesis describe la secuencia de interacciones de la PrimPol humana durante la síntesis de iniciadores y la relevancia del ZnFD en cada paso. Tanto la formación del complejo binario PrimPol:ssDNA como la subsiguiente interacción con el nucleótido 3´ (complejo pre-ternario) permanecen intactas cuando PrimPol carece del ZnFD. Por el contrario, se necesitó el ZnFD para la posterior unión y selección del nucleótido 5’, probablemente porque interactúa con su fosfato γ. Además, demostramos que el ZnFD contribuye al reconocimiento de la G críptica en la secuencia de iniciación preferida 3´GTC5´, y que a su vez también es esencial en los sucesivos eventos de translocación / elongación durante la síntesis del iniciador de DNA. Mediante mutagénesis dirigida de la PrimPol humana, confirmamos la relevancia catalítica de los ligandos del metal Asp114, Glu116 y Asp280, además identificamos el Glu116 como un potenciador relevante de las reacciones distintivas de PrimPol, las cuales son altamente dependientes de Mn2+. Por otra parte, evidenciamos que el Glu116 es importante para los eventos mediados por dislocaciones de iniciador/molde, y crucial para lograr una actividad primasa óptima, procesos en los cuales el Mn2+ es altamente preferido. El análisis del complejo pre-ternario reveló el papel crítico de cada ligando del metal y un deterioro significativo cuando se cambió el Glu116 a un aspartato convencional. Estos datos sugieren que el sitio activo de PrimPol requiere del motivo A específico (DxE) para favorecer el uso de Mn2+ esencial para la óptima estabilización del nucleótido entrante, especialmente durante la síntesis de iniciadores. Alineamientos de secuencias de aminoácidos de PrimPoles eucarióticas nos permitió identificar un motivo WxxY, altamente conservado, localizado muy cerca del motivo invariante A. Realizamos mutagénesis de los aminoácidos Trp87, Phe88, Tyr89, Tyr90 que forman el motivo WFYY en la PrimPol humana. Mostramos que una mutación específica en la Tyr89 (Y89D) del motivo WFYY de la PrimPol humana (presuntamente relacionada con la Miopía Magna) resultó ser irrelevante para las funciones enzimáticas in vitro de PrimPol. Por otro lado, la variante polimórfica humana F88L se vio afectada en las actividades primasa/polimerasa, especialmente durante las reacciones de TLS. Finalmente los residuos invariantes de Trp87 y Tyr90 mostraron ser cruciales para las actividades primasa y polimerasa de PrimPol, debido a su papel indirecto en la estabilización del nucleótido entrante en posición 3’.PrimPol is the second primase in human cells, the first with the ability to start DNA chains with dNTPs. PrimPol contributes to DNA damage tolerance by restarting DNA synthesis beyond the lesion acting as a TLS primase, skipping unreadable lesions as abasic sites, or "reading" certain lesions as 8-oxo-dG. PrimPol contains an Archeal-Eukaryotic Primases (AEP) core followed by a C-terminal Zn finger-containing domain (ZnFD) that was exclusively required for primer formation and for PrimPol function in vivo. The present thesis describes the sequential substrate interactions of human PrimPol during primer synthesis, and the relevance of the ZnFD at each individual step. Both the formation of a PrimPol:ssDNA binary complex and the upcoming interaction with the 3´-nucleotide (pre-ternary complex) remained intact when lacking the ZnFD. Conversely, the ZnFD was required for the subsequent binding and selection of the 5´-nucleotide most likely interacting with its γ-phosphate moiety. We demonstrate that the ZnFD contributes to recognize the cryptic G at the preferred priming sequence 3´GTC5´ being also essential in the subsequent translocation/elongation events during DNA primer synthesis. By site-directed mutagenesis in human PrimPol, we confirmed the catalytic relevance of the metal ligands Asp114, Glu116 and Asp280, and identified Glu116 as a relevant enhancer of distinctive PrimPol reactions, which are highly dependent on Mn2+. Herein, we evidenced that Glu116 was important for events mediated by primer/template dislocations, and crucial to achieving an optimal primase activity, processes in which Mn2+ is largely preferred. Pre-ternary complex analysis indicated a critical role of each metal ligand, and a significant impairment when Glu116 was changed to a conventional aspartate. These data suggest that PrimPol active site requires a specific motif A (DxE) to favor the use of Mn2+ required for optimal incoming nucleotide stabilization, especially required during primer synthesis. Amino acid sequence alignment of eukaryotic PrimPols allowed us to identify a highly conserved motif, WxxY, in close proximity to the invariant motif A. We performed mutagenesis of Trp87, Phe88, Tyr89, Tyr90 forming the WFYY motif in human PrimPol. We showed that a specific mutation at Tyr89 of WFYY human PrimPol motif (claimed to be relate to High Myopia, Y89D) was irrelevant for the in vitro enzymatic functions of PrimPol. The human polymorphic variant F88L was affected in primase/polymerase activities especially during TLS reactions whereas the invariant Trp87 and Tyr90 residues are crucial for both primase and polymerase activities of PrimPol, mainly due to their indirect role in in stabilizing the incoming 3´-nucleotide