Cellule staminali pluripotenti indotte umane per lo studio della microcefalia associata a WDR62

Con il termine microcefalia si definisce una condizione patologica per cui la circonferenza occipito-frontale del soggetto, tenendo conto dell’età e del sesso, misura oltre due deviazioni standard al di sotto della media. La microcefalia sottende un mancato sviluppo dell’encefalo e della corteccia cerebrale in particolare, da ricercarsi nella deplezione del numero di neuroni e glia; questa può essere dovuta ad un tasso proliferativo non fisiologico dei progenitori neurali, alla loro mancata o non corretta maturazione oppure alla morte precoce degli stessi e dei neuroni da essi derivanti. L’eziologia della microcefalia può risiedere in cause ambientali o genetiche. Tra le cause ambientali più comuni si ritrovano le infezioni da parte di agenti patogeni neurotropici (agenti del complesso TORCH: Toxoplasmosis, Others, Rubella, Cytomegalovirus, Herpes simplex); per quanto riguarda le cause genetiche, nella maggior parte dei casi, sono legate a mutazioni autosomiche recessive. Fino ad oggi sono stati identificati diciotto loci genici associati alla microcefalia, classificati da MCPH1 a MCPH18. In particolare, MCPH2 (OMIM 604317), la seconda forma più comune di microcefalia primaria (14.1% dei casi), è causata da mutazioni del gene WDR62 (WD repeat domain 62), localizzato sul cromosoma 19. Sono state riportate più di 40 diverse mutazioni frameshift, missenso, nonsenso o del sito di splicing a carico del gene WDR62; fenotipicamente tali mutazioni – oltre alla microcefalia – portano a pachigiria, corteccia inspessita, lissencefalia e polimicrogiria. Tutte queste condizioni trovano fondamento nel fatto che il prodotto proteico del gene WDR62 è coinvolto nell’assemblamento del fuso mitotico, nella progressione mitotica e nel mantenimento del pool di progenitori neurali. Questo lavoro di tesi si avvale dell’utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) per disease modeling. In particolare, le iPSCs da noi prese in esame sono state derivate dai fibroblasti ombelicali del caso clinico 1406-1, affetto da microcefalia. Il soggetto presentava una mutazione de novo omozigote: la delezione di 4 paia di basi a livello dell’esone 23 del gene WDR62 provoca uno slittamento della cornice di lettura (frameshift) risultante in un codone di STOP prematuro in posizione 1067. Il prodotto proteico derivante è un peptide tronco mancante di 569 amminoacidi nella porzione C-terminale. Dopo aver verificato che le WDR62 iPSCs soddisfacessero le caratteristiche di pluripotenza desiderate rispetto al CTRL, abbiamo investigato l’espressione e la localizzazione della proteina mutata nella popolazione WDR62 iPSCs. Rispetto al CTRL, dove nelle cellule mitotiche WDR62 si localizza ai poli del fuso mitotico, la proteina mutata appare mis-localizzata e diffusa attorno al nucleo delle cellule in divisione. Nonostante la mancata localizzazione di WDR62 mutata ai poli del fuso, il rate proliferativo delle WDR62 iPSCs non risulta significativamente alterato. Al fine di comprendere meglio il meccanismo coinvolto nella delocalizzazione di WDR62 e gli effetti che questo ha sui progenitori neurali, sul loro tasso di proliferazione e differenziamento, abbiamo avviato un protocollo di induzione neurale (mediante Dual SMAD inhibition) partendo dalle WDR62 iPSCs ottenendo sia neuroni corticali maturi sia una popolazione self-renewing di cellule staminali neuroepiteliali (iPSC-NES). In parallelo, lo stesso protocollo di derivazione neurale è stato applicato alle iPSCs CTRL. Indagando a tre time-points significativi la progenie neurale ottenuta a partire dalle WDR62 iPSCs (Day in vitro 16, 40 e 80), confrontandola con quella di CTRL, abbiamo verificato che il protocollo ha permesso di derivare efficacemente progenitori neurali, neuroni maturi – con identità corticale – e cellule gliali. In particolare, nei progenitori al day in vitro 16-WDR62 abbiamo individuato una diminuzione del tasso proliferativo nel mutato rispetto al CTRL. Grazie agli studi di co-localizzazione condotti sulla popolazione WDR62 iPSC-NES, è stato possibile seguire il destino della proteina mutata nelle diverse fasi del ciclo cellulare identificando un accumulo della stessa a livello dell’apparato di Golgi. In conclusione, queste progenie cellulari rappresentano una piattaforma per investigare il ruolo di WDR62 nella normale biologia delle cellule staminali neurali umane e i meccanismi eziopatogenici alla base della microcefalia