Mechanical and functionnal properties of respiratory epithelial cells exposed to a bacterial toxine : the adenylate cyclase

La recrudescence des infections respiratoires impliquant des facteurs virulents d’origine bactérienne est devenue un problème majeur de santé publique. Mieux caractériser la réponse des cellules respiratoires dans la phase initiale d’exposition à des toxines bactériennes est important sur les plans physiopathologiques et thérapeutiques. Le but de ce travail est de décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors de l’exposition des cellules épithéliales respiratoires à l’adénylate cyclase (CyaA), une toxine produite par Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche. CyaA a été choisie car elle dispose de multiples moyens qui lui permettent d’envahir un grand nombre de cellules eucaryotes. Elle est notamment capable de transloquer son domaine catalytique directement dans la cellule cible puis d’utiliser la calmoduline endogène pour augmenter le taux d’AMPc à des niveaux supraphysiologiques. Cependant l’effet de ces changements sur la signalisation mécano-chimique (mécanotransduction) a été très peu décrit alors qu’elle affecte les fonctions et l’intégrité cellulaires. Nous proposons donc d’évaluer les fonctions cellulaires et les propriétés mécaniques et d’adhésion des cellules épithéliales respiratoires exposées à CyaA dans le but de déceler des modifications fondamentales dans les processus de mécanotransduction.Nous avons tout d’abord mené une étude préliminaire visant à définir les concentrations physiopathologiques de CyaA utilisées dans nos expériences. Nous avons ainsi déterminé le degré de viabilité cellulaire en fonction de 3 concentrations de CyaA (0.5 ; 5 ; 10 nM), ce qui a montré que la concentration 0.5 nM n’affectait pas la viabilité cellulaire tout en induisant des niveaux supraphysiologiques d’AMPc en moins d’une heure.Nous avons ensuite cherché à évaluer les effets de CyaA sur la migration et la réparation cellulaires, le battement ciliaire et la perméabilité cellulaire de cellules épithéliales représentatives des différents niveaux de l’arbre aérien. CyaA induit une diminution de la migration et de la réparation cellulaires, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité cellulaire traduisant un affaiblissement des jonctions latérales.Une étude en immunoflorescence a ensuite été conduite sur les structures intracellulaires et interfaciales des cellules épithéliales alvéolaires exposées aux 3 concentrations de CyaA. Cette étude a montré que CyaA est capable d’induire un remodelage du cytosquelette d’actine ainsi qu’une diminution du nombre des adhérences focales. Enfin, une analyse complète des propriétés mécaniques et des paramètres d’adhésion a été conduite sur les mêmes cellules au moyen de 2 techniques de micro/nanomanipulation revisitées pour permettre à la fois l’évaluation des liens multiples et de la rigidité cellulaire (Microscopie à Force Atomique (AFM) avec indentation et Magnétocytométrie (MTC)). Pour évaluer le rôle de l’AMPc sur les changements observés, les cellules épithéliales respiratoires ont été testées avec la forme active de CyaA et la forme enzymatiquement inactive de la toxine : CyaAE5, qui ne permet pas de synthétiser l’AMPc.Les expériences AFM ont révélé que le principal effet de CyaA est de diminuer le nombre de liens intégrine-ligand associés (une altération du clustering) alors qu’à la plus faible concentration de CyaA, nous observons une augmentation de la rigidité cellulaire, accompagnée d’un renforcement des liens individuels, évolutions confirmées par les résultats MTC. CyaAE5 ne parvient pas à produire ces mêmes effets.L’ensemble des résultats suggère que CyaA affecte de façon précoce la mécanotransduction des cellules exposées et ceci en cohérence avec les effets attendus de l’augmentation d’AMPc (remodelage du CSQ, altération des jonctions latérales, inhibition de l’expression de Rac1), ce qui apporte une nouvelle vision de la cytotoxicité induite par l’adénylate cyclase.The increase in respiratory infections involving virulent factors of bacterial origin has become a major public health issue. A better knowledge of the cell respiratory response in the course of the initial cell invasion by bacterial toxins is important from the pathophysiological and therapeutical point of views.The purpose of this work is to decipher the cellular and molecular mechanisms involved in the exposition of respiratory epithelial cells to the adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis which is the whooping cough agent. We have chosen this toxin for its multiple capacities of penetrating a wide range of eukaryotic cells. Indeed, this toxin enables direct translocation of its catalytic domain across the plasma membrane of target cells using the endogen calmoduline to increase the cAMP rate at supraphysiological levels. However, the effects of these changes on mechano-chemical signaling (mechanotransduction) pathways remain largely unknown while it affects cellular functions and cell integrity. So, we perform an evaluation of cellular functions as well as mechanical and adhesion properties of respiratory epithelial cells exposed to CyaA toxin in order to detect some critical modifications in the mechanotransduction processes.In a preliminary study aiming at defining physiopathological concentrations of CyaA toxin used in our experiments, we determined the cell viability degree for 3 concentrations of CyaA toxin (0.5; 5 and 10 nM). We found that the smallest concentration (0.5 nM) did not affect cell viability whereas inducing supraphysiological cAMP levels in less than one hour.Then, we assessed the effects of CyaA toxin on cell migration and repair phenomenon, on ciliary beating and on cell permeability of epithelial cells representative of the different levels of the respiratory tract. The toxin induces a decrease in cell migration and repair, an increase in cell permeability suggesting a weakening of lateral cell-cell junctions.Immunostaining was performed on intracellular and interfacial structures of alveolar epithelial cells exposed to the 3 concentrations of CyaA toxin. Results show that CyaA toxin is able to induce cytoskeleton remodeling and a decrease in the number of focal adhesions. Finally, a refined analysis of mechanical properties and adhesion parameters was performed on the same cells by 2 techniques of micro/nanomanipulation modified to permit at the same time, an evaluation of cell adhesion and cell rigidity (Atomic Force Microscopy with indentation and force spectroscopy to characterize the number of bond during adhesion reinforcement and multiscale Magnetic Twisting Cytometry). To evaluate the role of cAMP on cellular and molecular changes, we tested the enzymatically inactive form of CyaA toxin called CyaAE5 which could not permit to increase the intracellular cAMP rate.The AFM experiments have revealed that the main effect of CyaA toxin is to decrease the number of associated integrin-ligand bounds (meaning an alteration of clustering) while, at the smallest concentration of CyaA toxin, we observe an increase in cell rigidity with an individual bound reinforcement, a result consistent with MTC results. Nevertheless, CyaE5 does not exhibit such cellular effects. On the whole, these results suggest that CyaA toxin affects the mechanotransduction pathways of cells exposed to the toxin, a result which is in agreement with the expected effects of cAMP increase (notably cytoskeleton remodeling, lateral junction alteration and inhibition of Rac1 expression) what brings a new vision of the cytotoxicity induced by the adenylate cyclase toxin