CONTROLLO DELLA FORMAZIONE DI BIOFILM DI SALMONELLA SPP CON DOSI SUB-MIC DI OLI ESSENZIALI

I sierotipi di Salmonella spp, un genere patogeno di Enterobacteriaceae, sono responsabili di infezioni in animali da sub-cliniche a severe, nonchè di febbre tifoide e diarrea severa negli uomini (Foley et al, 2008). Questi batteri Gram negativi sono una delle maggiori cause di preoccupazione per l’industria veterinaria. Nel particolare, i polli e i maiali sono noti come i maggiori veicoli di Salmonella. Grandi sforzi sono rivolti al controllo della colonizzazione di Salmonella nei reservoir di maiali e polli poiché questi animali, se infetti, generalmente ospitano il batterio in modo asintomatico nelle tonsille, nell’intestino e nel tessuto linfoide associato all’intestino (GALT) (Boyer et al 2008). Per questo anche la European Food Safety Authority (EFSA) considera i sierotipi di Salmonella isolati da maiali e da polli un pericolo per la salute pubblica (EFSA, 2006) tanto da istituire misure di controllo atte alla riduzione della prevalenza della Salmonella spp specialmente negli allevamenti in cui la produzione di polli e maiali è aumentata negli anni (Evangelopoulou et al, 2015 Foley 2008). Il primo scopo del nostro studio è stato quello di testare l’efficacia degli oli essenziali (OE) di Lavandula intermedia e Coridothymus capitatus e di GR-OLI, una formulazione veterinaria a base di OE (25% del totale caratterizzato da: Eucalyptus globulus, Satureja Montana, Citrus aurantium, Thymus vulgaris, Melaleuca alternifolia, Citrus lemon, Lavandula intermedia, Melaleuca cajeputi, Coridothymus capitatus), su 20 ceppi di Salmonella spp isolati da allevamenti di polli e maiali, 2 ceppi di Saccharomyces cerevisiae e 2 ceppi di Saccharomyces boulardii appartenenti alla collezione microbica dell’Università di Bologna. Il secondo scopo è stato quello di individuare le dosi sub-MIC in grado di inibire la formazione di biofilm e la capacità adesiva di ceppi di S. typhimurium sensibili e resistenti agli antibiotici. Il primo scopo è stato raggiunto eseguendo test di micro-brodo diluizione in linea con le linee guida internazionali EUCAST. Il secondo scopo è stato raggiunto coltivando biofilm di S. typhimurium o valutando la loro adesione sulle cellule intestinali umane CaCo-2 in presenza di diluizioni sub-MIC degli OE e del GR-OLI. Inoltre è stata valutata l’azione delle sub-MIC studiando, in tempo reale, le curve di crescita dei ceppi batterici. I nostri risultati mostrano la maggiore efficacia dell’OE di C. capitatus (MIC90 = 0.5% v/v) e GR-OLI (MIC90=1%v/v) se paragonata a quella dell’OE di L. intermedia EO (MIC90≥2% v/v). Inoltre, le MIC di questi OE vs i ceppi probiotici sono più alte (MIC uguale a 1% - 2% e >2% v/v, rispettivamente per C. capitatus, GR-OLI e L. intermedia EO). I dati preliminari sull’inibizione della formazione del biofilm e sull’adesione dei ceppi alle cellule, mostra come il GR-OLI sia efficace quando usato a concentrazioni sub-MIC comprese tra 0.25% e 0.03% v/v. Le curve di crescita di S. typhimurium mostrano l’efficacia del C. capitatus e GR-OLI sia sui ceppi sensibili che resistenti agli antibiotici, mentre l’OE di L. intermedia inibisce solo i ceppi sensibili. I nostri dati preliminari mostrano come sia possibile usare concentrazioni sub-MIC di OE per rendere la Salmonella meno virulenta senza interferire con la vitalità dei ceppi appartenenti al microbiota intestinale. Ulteriori studi devono essere fatti per confermare i nostri dati e studiare l’eventuale, anche se improbabile, sviluppo di resistenze agli OE. Salmonella spp., a pathogenic genus of Enterobacteriaceae, has serovars causing subclinical to severe clinical infections in animals, and typhoid fever and severe diarrhoea in humans (Foley, 2008). These Gram negative bacteria are one of the major causes of concern for the veterinary industry. Particularly, chickens and pigs are recognized as a major vehicle for Salmonella. Recently, great importance has been given to practices aimed at controlling the colonization of Salmonella in pig and chicken reservoirs: in fact infected animals, such as pigs, generally carry these bacteria asymptomatically in the tonsils, the intestines and the gut-associated lymphoid tissue (GALT) (Boyer 2008). For these reasons, strains isolated from pigs and chickens are considered a hazard for public health also by the European Food Safety Authority (EFSA) (EFSA, 2006); thisis a real incentive for some nations in undertaking control measures aiming at their reduction in farms where pigs and chickens breeding has increased over the years (Evangelopoulou et al, 2015 Foley 2008). The first aim of our study was to test the effectiveness of both Lavandula intermedia and Coridothymus capitatus essential oils (EOs) and GR-OLI, a veterinary formulation based on EOs (25% of a total characterised by Eucalyptus globulus, Satureja Montana, Citrus aurantium, Thymus vulgaris, Melaleuca alternifolia, Citrus lemon, Lavandula intermedia, Melaleuca cajeputi, Coridothymus capitatus), on 20 strains of Salmonella spp isolated from poultry and pig farms, 2 probiotic strains of Saccharomyces cerevisiae and 2 of Saccharomyces boulardii belonging to the University of Bologna microbial collection. The second aim was to identify sub-MIC doses that are able to inhibit the biofilm formation and the adhesion capacity of S. typhimurium strains, both sensitive and resistant to antibiotics. The first aim was reached using the micro-broth dilution test in line with EUCAST international guidelines to identify MIC values. The second aim was achieved growing S. typhimurium biofilm or evaluating its adhesion to CaCo-2 intestinal human cells in presence of sub-MIC dilutions of both EOs and GR-OLI. Furthermore, the activity of sub-MICs on strains growth was evaluated by studying, in real time, their growth curves. Our results show the major effectiveness of the C. capitatus EO (MIC90 = 0.5% v/v) and GR-OLI formulation (MIC90=1%v/v) if compared to L. intermedia EO (MIC90≥2% v/v). However, the effectiveness of these ones vs probiotic strains is observed at higher concentrations (MIC equal to 1% - 2% and >2% v/v, respectively of C. capitatus EO, GR-OLI formulation and L. intermedia EO). Furthermore, preliminary data on inhibition of both biofilm formation and cell adhesion show the effectiveness of GR-OLI when used at sub-MIC doses between 0.25% and 0.03% v/v. Data from growth curves show the effectiveness of C. capitatus EO and GR-OLI on both antibiotic sensitive and resistant strains, while L. intermedia EO is able to inhibit the growth of only antibiotic sensitive strains. Our preliminary data show that it is possible to use sub-MIC concentrations of EOs to make Salmonella spp., if present, less virulent than in normal conditions, without interfering with the viability of strains belonging to the intestinal microbiota. Further studies need to be done in order to confirm our data and study the possibility, although unlikely, to develop strain resistance vs EOs