PROPRIETA' DINAMICHE STRUTTURALI E FUNZIONALI DI PROTEINE IN SISTEMI NON-LIQUIDI CONTENENTI ACQUA RESIDUA: ACCOPPIAMENTO CON LA MATRICE ESTERNA

L’accoppiamento strutturale/dinamico tra proteina e solvente in matrici non-liquide è stato studiato utilizzando approcci spettroscopici diversi (XAFS, spettrofotometria risolta nel tempo, scattering di neutroni) ottenendo informazioni complementari riguardanti rispettivamente: a) la struttura e dinamica locale di centri metallici a risoluzione subatomica; b) l’accoppiamento tra dinamica interna della proteina e trasferimento elettronico; c) la dinamica media dei protoni della proteina. In collaborazione con le Unità di Palermo e di Bari, mediante spettroscopia XAFS è stato esaminato l’atomo di Fe in citocromo (cit) c, in carbossimioglobina (MbCO) e nel centro di reazione fotosintetico batterico (CR), confrontando la struttura/dinamica locale dei siti metallici in soluzione, in film di polivinil alcool (PVA) ed in matrici disidratate di trealosio e di saccarosio. La matrice di PVA interagisce debolmente con la proteina, come indica l’assenza di effetti sugli spettri XAFS. Al contrario, in cit c, l’incorporazione in trealosio produce distorsioni strutturali significative (allungamento di alcune distanze di coordinazione sino a 0.2 Å), accompagnate da una impressionante diminuzione degli spostamenti quadratici relativi dei primi ligandi. Analoghi dati in MbCO mostrano che la matrice di trealosio altera drasticamente il paesaggio energetico della proteina. Coerentemente con queste conclusioni, anche nel caso del CR, in matrici disidratate di trealosio si ha un allungamento delle distanze di legame per due delle quattro istidine di coordinazione. A differenza di quanto osservato in matrici di trealosio, quando il cit c è inserito in un disaccaride omologo, il saccarosio, la struttura locale dell’atomo di Fe ed i parametri di disordine non sono sensibilmente alterati rispetto alla soluzione, rivelando un accoppiamento proteina-matrice estremamente debole in saccarosio. Queste conclusioni sono pienamente supportate dagli studi sul trasferimento elettronico e sulla stabilità termica di CR, incorporati in matrici di trealosio e di saccarosio. In trealosio, l’analisi della cinetica della ricombinazione di carica dello stato a carica separata P+QA- al diminuire del contenuto di acqua della matrice indica una inibizione progressiva e drammatica della dinamica conformazionale del CR associata al rilassamento dallo stato adattato al buio a quello adattato alla luce. L’effetto non si produce in matrici di saccarosio, anche in condizioni estreme di disidratazione, rivelando come nel caso di questo disaccaride si verifichi una sorta di separazione di fase su scala nanometrica. Il disaccoppiamento proteina-matrice in saccarosio è ulteriormente evidenziato dallo studio della denaturazione termica del CR. L’incubazione a 37°C in saccarosio per 5 giorni determina infatti nel CR la perdita irreversibile dell’attività fotochimica, in modo analogo a quanto si osserva in film di RC disidratati in assenza di zucchero. L’integrità del CR è invece totalmente preservata in trealosio per diverse settimane. Misure di scattering quasi-elastico di neutroni sono state condotte in collaborazione con l’Unità di Bari su CR in soluzione, su CR incorporati in una matrice disidratata di trealosio deuterato ed in film di CR disidratati in assenza di saccaridi. I risultati mostrano che: a) il moto dei protoni del CR è drasticamente ridotto nella matrice di trealosio rispetto alla soluzione; b) il contributo quasi elastico è marcatamente maggiore nel film di RC disidratato in assenza di zucchero rispetto alla matrice di trealsoiso, nonostante il contenuto in acqua residua del film sia inferiore. La riduzione della dinamica osservata in trealosio non è quindi riconducibile unicamente alla disidratazione, ma dipende criticamente dall’interazione proteina-acqua-trealosio, in accordo con gli effetti osservati sul trasferimento elettronico. L’insieme dei risultati è consistente con il modello da noi proposto, secondo il quale l’accoppiamento proteina-matrice saccaridica è regolato da una rete di legami idrogeno che connette gruppi superficiali della proteina e matrice mediante molecole d’acqua residua. L’intensità dell’accoppiamento dipende quindi criticamente dalla struttura/dinamica della specifica molecola saccaridica della matrice