Applicazioni di tecniche spettroscopiche vibrazionali Raman e IR alla caratterizzazione di proteine e lipidi dell'occhio e di estratti lipidici dell'orata prima e dopo trattamento con Cu++.

none3La spettroscopia vibrazionale è da tempo impiegata con successo per l'analisi strutturale di proteine e di lipidi. E' infatti possibile studiare la struttura secondaria delle proteine, la quantità e la struttura dei legami C-S, S-S e S-H che coinvolgono gli aminoacidi contenenti zolfo, la percentuale di acqua nel campione, la struttura e l'orientazione di alcuni aminoacidi aromatici come la tirosina, il triptofano e la fenilalanina. Per quanto riguarda invece i lipidi è possibile analizzare il grado di insaturazione dei grassi di origine animale e la conformazione dei legami C-C e C-H. Con la tecnica Raman sono stati esaminati campioni di cristallino, cornea e membrana nittitante di orate di controllo e di orate dopo permanenza per 106 gg in acque trattate con 0,5 ppm di rame. In particolare si è concentrata l'attenzione sul cristallino, effettuando misure localizzate sia nel nucleo, sia sulla superficie per esaminare il diverso contenuto proteico delle due zone. La spettroscopia infrarossa (IR) è stata invece impiegata anche per lo studio di campioni di estratti lipidici provenienti dal fegato e dal grasso (dopo 50 giorni di trattamento) di orate di controllo e di orate dopo permanenza in acque trattate con 0,5 ppm di rame. Gli spettri Raman sono stati registrati con le tecniche Micro-Raman e Macro-Raman. Gli spettri IR degli estratti lipidici sono stati registrati con la tecnica ATR (Attenuated Total Reflection) facendo aderire il campione da esaminare su una superficie di diamante, che permette il passaggio della radiazione infrarossa. II cristallino è costituito in prevalenza da proteine appartenenti alla famiglia delle cristalline. Queste proteine sono state ben caratterizzate in altri animali (bovini, suini, conigli) e risultano particolarmente stabili alle modificazioni ambientali perché associate ad altri peptidi (ad esempio il glutatione) che rispondono ad eventuali stress (cataratta, perforazione della cornea, tumori). La loro struttura è prevalentemente di tipo -sheet. Nello spettro Raman le bande più significative per la presenza di proteine sono: - ammide I, dovuta prevalentemente al C=O, nella regione 1690-1620 cm-1; - ammide III, vibrazione meno specifica delle precedenti, ma sempre dovuta al gruppo peptidico, nella regione 1230-1310 cm-1: questi due modi di vibrazione danno informazioni sulla struttura secondaria della proteina. La banda ammide I è straordinariamente sensibile alla struttura secondaria. Tra le altre bande dello spettro Raman, di particolare interesse per lo studio delle variazioni nella struttura proteica sono quelle relative ai legami S-H e S-S. Lo studio di queste bande viene spesso citato nella letteratura relativa alle proteine delle lenti oculari (Pande; Chen). I legami S-S sono dovuti alla formazione di ponti disolfuro e sono direttamente collegati all'ossidazione dei residui S-H delle cisteine: un aumento di intensità relativa della banda S-S è un indice dell'ossidazione delle cisteine e di un irrigidimento della struttura proteica. Il rapporto di intensità tra la banda degli S-H ed una banda adiacente a 2730 cm-1 (overtone) permette di calcolare il numero di tioli per unità di proteina. Infine, si possono ottenere interessanti informazioni sulle proteine esaminando le bande relative agli aminoacidi aromatici, in particolare la tirosina e il triptofano. Infatti il doppietto della tirosina a 830-860 cm-1 è utilizzato per determinare se il gruppo OH legato all'anello aromatico sia donatore o accettore di legami ad idrogeno. Lo studio del nucleo e della corteccia del cristallino di orate di riferimento e di orate rimaste per 106 giorni in acque trattate con 0.5 ppm di rame non hanno evidenziato particolari variazioni né nella struttura secondaria, né nella conformazione dei legami S-H e S-S, né nella variazione dell'intorno degli aminoacidi aromatici. Anche lo studio della cornea e della membrana non ha rivelato differenze significative prima e dopo la permanenza delle orate ...noneM. Di Foggia; A. Tinti; C. FagnanoM. Di Foggia; A. Tinti; C. Fagnan