96. Specie fungine produttrici di ocratossina A nei salami lombardi prodotti negli anni 2011-2014.

Le muffe appartenenti ai generi Aspergillus e Penicillium spesso presenti sulla superficie dei salami, regolano il pH e il grado di umidità per la corretta stagionatura del prodotto. Sebbene la legge italiana consenta l'utilizzo di colture starter di Penicillium chrysogenum e di P.nalgiovense nella produzione degli insaccati crudi (D.M. 28/12/1994 G.U. n. 89), i produttori di salame tradizionale non ne fanno utilizzo permettendo la crescita dei funghi naturalmente presenti nell'aria degli ambienti di stagionatura. Alcuni ceppi di Aspergillus (soprattutto A.ochraceus, A. westerdijkiae, A. carbonarius e A. niger) e di Penicillium (P. verrucosum e P. nordicum) possono produrre e rilasciare nel salame ocratossina A (OTA). Lo scopo di questo lavoro è il monitoraggio della flora fungina colonizzante i salami tradizionali prodotti in Lombardia negli anni 2011-2014 con valutazione delle tecniche per la rilevazione di ceppi ocratossinogeni. La flora fungina di 123 salami con stagionatura variabile (1 settimana - 7 mesi) è stata ricercata secondo il metodo ISO 21527:2008 per la numerazione di lieviti e muffe. Sono stati isolati 235 ceppi di cui 155 appartenenti al genere Penicillium e 15 appartenenti al genere Aspergillus. L'identificazione delle specie è stata condotta sfruttando le caratteristiche colturali e morfologiche come previsto dalle chiavi di identificazione di Samson (2010). L'identificazione dei 37 ceppi più rappresentati è stata confermata sequenziando il frammento comprendente le regioni ITS1 (Internal Trascribed Spacer 1) e ITS2 del rDNA e per 15 di questi, 14 Penicillium e 1 Aspergillus, è stata inoltre sequenziata una porzione del gene della β tubulina come ulteriore conferma. Le sequenze ottenute da ciascun campione sono state confrontate in banca dati NCBI mediante il programma BLAST. Per 4 salami (2 provenienti dalla provincia di Pavia, uno da Milano e uno da Monza e Brianza) in cui sono stati isolate specie potenzialmente ocratossinogene (3 A. westerdijkiae e 1 P. nordicum) la ricerca dell'ocratossina A è stata condotta attraverso cromatografia liquida accoppiata in tandem alla spettrometria di massa. L'identificazione a livello morfologico delle specie fungine a causa dell'esistenza di specie morfologicamente affini tra loro, ha fornito solamente un'indicazione a livello di gruppo e perciò ha reso necessaria una conferma molecolare. L'identificazione delle specie ottenuta mediante il sequenziamento del frammento ITS ha confermato l'identificazione a livello di gruppo. Il sequenziamento della porzione del gene della β tubulina ha permesso l'identificazione fino al livello di specie per tutti i ceppi. Per verificare l'attendibilità delle tipizzazioni e in particolare modo quelle riguardanti i ceppi potenzialmente micotossinogenici si è ricercata l'OTA nei 4 salami colonizzati. In 2 salami la quantità di OTA è risultata ben superiore alla quantità massima suggerita per legge per carni suine e prodotti derivati (1 µg/kg) (Circ. Min. San. n. 10 09/06/1999 G.U. n.135). In uno di questi si è riscontrato un livello di OTA 600 volte superiore al limite, mentre nell'altro di 7 volte. Nei rimanenti due salami la quantità di micotossina superava di poco i limiti previsti. In un salame colonizzato da A. westerdijkiae e positivo ad OTA (1,4 µg/kg), ricreando le condizioni ideali per la micotossinogenesi (aw< 0,79 e T=20-30 °C) si è ottenuta una massiccia sintesi di tossina nell'arco di 10 giorni (3,7 µg/kg). Attualmente stiamo procedendo con la messa a punto di una metodica di PCR Real Time mirata a riscontrare la presenza di funghi ocratossinogeni amplificando geni coinvolti nella biosintesi della tossina