Rimodellamento vascolare ed attività ovarica

Il presente progetto di ricerca ha lo scopo di chiarire il ruolo del processo angiogenetico nella modulazione dell'attività ovarica, con particolare riferimento allo sviluppo ed alla maturazione del follicolo, alla sua evoluzione in corpo luteo ed alla regressione dello stesso. Una parte del progetto consisterà nella valutazione del ruolo svolto dalle metalloproteinasi della matrice (MMPs) e dai loro inibitori (TIMPs) nel processo di neovascolarizzazione del follicolo; il sistema MMPs/TIMPs è infatti coinvolto nella dissoluzione e nel rimodellamento della matrice extracellulare. I livelli di MMPs/TIMPs verranno determinati nel liquido follicolare prelevato da follicoli di scrofa in diverse fasi di sviluppo e nei media di coltura condizionati dalle cellule della granulosa prelevate dagli stessi follicoli; sulle stesse cellule verrà testata l'espressione genica di MMPs/TIMPs anche in condizioni di ipossia indotta sia con mezzi fisici che chimici. Lo stesso sistema MMPs/TIMPs verrà utilizzato per valutarne gli effetti modulatori su VEGF, bFGF, NO e H2O2. Inoltre, siccome le MMPs sembrano essere inibite dall'epigallocatechina-3-gallato (EGCG), costituente del tè verde spesso utilizzato per supplementare la razione, e dall'alcaloide sanguinarina, si verificherà se queste sostanze hanno effetti negativi sulla follicologenesi; a tal fine verrà determinata la steroidogenesi e la proliferazione in cellule della granulosa trattate con EGCG e con sanguinarina e verrà verificato l'effetto antiossidante delle molecole mediante determinazione di O2-, H2O2 ed NO nonché sugli enzimi superossidodismutasi, catalasi, perossidasi ed ossido nitrico sintetasi. Si verificherà inoltre l'eventuale presenza del 2-metossiestradiolo (un metabolita dell'estradiolo) a livello follicolare e la sua produzione da parte della cellule della granulosa; si ritiene che questo metabolita sia un inibitore fisiologico dell'angiogenesi follicolare. Il progetto prevede inoltre di verificare il coinvolgimento di alcune citochine nell'angiogenesi e nella regressione vascolare a livello del corpo luteo. Lo studio verrà effettuato su corpi lutei di scrofa prelevati in diverse condizioni (pochi giorni dopo l'ovulazione, durante il periodo di riconoscimento materno di gravidanza, al 35°- 40° giorno di gravidanza), sottoposti sia ad induzione della luteolisi mediante prostaglandine sia a stress metabolici (digiuno dell'animale prima del prelievo del tessuto luteinico). Sul tessuto luteinico (nonchè su liquido uterino e su campioni di mucosa uterina) verranno studiati promotori genici legati al fenomeno apoptotico come Egr-1 e NFkB e promotori collegati allo stress cellulare quali HIF alfa e beta. Verrà inoltre determina l'espressione di citochine come TNF-alfa, IL-10, TGF-beta, IL-1beta e INF-gamma; ancora, verrà preso in considerazione il sistema endotelina-1 con i suoi recettori. Si valuterà inoltre il ruolo di proteine coinvolte nella risposta allo stress ossidativo ed ipossico come le HSP. Le determinazioni verranno effettuate mediante tecnica di gel shift, Western blot, RT-PCR in real time, ELISA e RIA. Verrà inoltre studiato, durante i processi di crescita e atresia follicolare e durante lo sviluppo e la regressione del corpo luteo nella coniglia, il ruolo intraovarico di alcuni fattori di origine endoteliale come VEGF, ET-1, TGF-alfa e FGF nonché di alcune citochine. In particolare, si analizzerà la cinetica dell'espressione genica, durante la luteolisi, delle sostanze sopra riportate; si studierà ancora la localizzazione e la distribuzione dell'ET-1, della COX-2 e dei recettori per le PGF a livello ovarico mediante tecniche immunoistochimiche. Infine, si studieranno le risposte dell'asse surrenalico e gonadico, in vivo, allo stress acuto endotossico, mediante determinazione delle concentrazioni plasmatiche di cortisolo, progesterone, estradiolo ed LH; gli effetti del trattamento con LPS in diverse strutture ovariche (follicoli e CL) verranno studiati anche in vitro