Infección por Clostridium difficile: caracterización molecular y estudio de las recurrencias.

[spa] Clostridium difficile es la primera causa de diarrea nosocomial, asociada a antibióticos, pero también una causa cada vez más frecuente de diarrea comunitaria. La infección por C. difficile (ICD) está mediada por aislados toxigénicos que producen toxinas A y/o B, que constituyen el principal factor de virulencia de este microorganismo. Algunas cepas, incluidos ribotipos (RT) hipervirulentos como el R027 o R078, pueden producir una tercera toxina, denominada toxina binaria, cuyo papel en la infección no está claro. Después de un primer episodio, la diarrea por C. difficile puede reaparecer, dando lugar a recurrencias de la enfermedad en un 20-30% de los casos. A lo largo de los últimos años se ha producido un incremento progresivo de la incidencia de ICD en nuestro ámbito, tanto a nivel hospitalario (de 1,74 episodios/10000 pacientes-día en 2013 a 4,2 episodios/10000 pacientes-día en 2016) como en la comunidad (de 8 episodios/100000 hab-año en 2015 a 27,46 episodios/100000 hab-año en 2016), siendo el R014/20 el más prevalente seguido del R078 en ambos ámbitos y del R106 en la ICD hospitalaria. El objetivo principal de este trabajo fue realizar la caracterización molecular de los aislados de C. difficile toxigénico de pacientes del Hospital Universitario Son Espases (HUSE) con ICD recurrente para la clasificación de recidivas (recurrencias causadas por la misma cepa) frente a reinfecciones (causadas por diferentes cepas) entre los años 2015-2016; así como estudiar los posibles cambios en el fitness (tasas crecimiento) y la virulencia (mediante la optimización de un modelo animal de infección con Galleria mellonella) de los aislados recidivantes. Otros objetivos fueron estudiar el perfil de sensibilidad antimicrobiana de los aislados así como realizar un análisis comparativo de diferentes técnicas para el tipado molecular. Se caracterizaron 65 aislados de 29 pacientes con ICD recurrente mediante PCR múltiple para secuenciotipo-slpA y ribotipado (electroforesis convencional y en gel capilar) y se determinó su perfil toxigénico mediante PCR. También se determinó la sensibilidad antimicrobiana a metronidazol, vancomicina, eritromicina y moxifloxacino mediante Etest® Se optimizó el modelo de infección con larvas de G. mellonella por vía oral con diferentes cepas de C. difficile para evaluar su mortalidad y se realizaron curvas de crecimiento de aislados recidivantes. Se identificaron un total de 25 ribotipos diferentes, siendo el R106 el más prevalente (29%), seguido del RAI-8/0 (8%) y el R014 (8%). El 69% de los pacientes presentaron recidivas, frente a un 28% de reinfecciones. Todos los aislados, excepto uno deficiente en toxina A, presentaron ambas toxinas y tan solo en el 9% se detectó la toxina binaria. No se observaron diferencias en las tasas de crecimiento entre los aislados recidivantes. En conclusión, la ICD recurrente es debida, en un mayor número de pacientes, a recidivas, no pudiéndose asociar las cepas recidivantes a cambios en el fitness, aunque sí a un ribotipo mayoritario, el R106. Finalmente, la técnica de ribotipado por electroforesis en gel capilar nos ha permitido obtener una mayor precisión y mejor discriminación entre ribotipos que la técnica convencional, permitiendo, además, el intercambio de datos entre laboratorios.[eng] Clostridium difficile is the leading cause of nosocomial diarrhea, which is associated with antibiotics, but it is also an increasingly cause of community acquired diarrhea. C. difficile infection (CDI) is mediated by toxigenic isolates that produce toxins A and/or B, which are the main virulence factors of this microorganism. Some strains, including hypervirulent ribotypes (RT), such as R027 or R078, may produce a third toxin, the binary toxin, whose role during the infection process remains unclear. After a first episode, C. difficile diarrhea may return, resulting in recurrences of the disease in 20-30% of the cases. Over the last few years there has been a progressive increase in the incidence of CDI in our setting, both at hospital level (from 1,74 episodes/10000 patients-day in 2013 to 4,2 episodes/10000 patients-day in 2016) and community level (from 8 episodes/100000 hab-year in 2015 to 27,46 episodes/100000 hab-year in 2016), R014/20 as the most prevalent followed by R078 in both scenarios, and R106 in the hospital-associated CDI. The main objective of this work was to perform the molecular characterization of C. difficile toxigenic isolates from patients with recurrent CDI at the Hospital Universitario Son Espases (HUSE) to study relapses (recurrences caused by the same strain) against reinfections (caused by different strains) between 2015-2016; as well as to study possible changes in fitness (growth rates) and virulence (through optimization of a Galleria mellonella infection model) of the relapsing isolates. Other objectives were to study the antimicrobial susceptibility profile and to perform a comparative analysis of different techniques for molecular typing. A total of 65 isolates from 29 patients with recurrent CDI were identified by multiplex PCR for sequence type-slpA and PCR-ribotyping (conventional and capillary gel-based electrophoresis) and the toxigenic profile was determined by PCR. Antimicrobial susceptibility to metronidazole, vancomycin, erythromycin and moxifloxacin was determined by Etest®. The animal model was optimized for oral infection of G. mellonella larvae with different strains of C. difficile to evaluate mortality, and growth curves were performed in relapsing isolates. A total of 25 different ribotypes were identified, being R106 the most prevalent (29%), followed by RAI-8/0 (8%) and R014 (8%). 69% of the patients had relapses, unlike 34% of reinfections. All isolates, except for one deficient in toxin A, had both toxins and only 9% produced the binary toxin. There were no differences in growth rates between recurrent isolates. In conclusion, recurrent CDI was due to relapse in most patients, and relapsing strains were associated with changes in growth rate, although the most prevalent ribotype, R106, can be associated. Finally, the capillary gel-based electrophoresis PCR-ribotyping method showed greater accuracy and discrimination between ribotypes, allowing inter-laboratory data exchange