Estudio del papel de las proteínas fimbriales en la formación de biofilm en Klebsiella pneumoniae

[spa] Klebsiella pneumoniae es un patógeno oportunista gram-negativo que puede causar infecciones en el tracto urinario y neumonías, en caso de pacientes inmunocomprometidos, tiene un ratio de mortalidad de entre el 25 al 60%. Se ha demostrado que posee varios factores de virulencia, entre ellos, la capacidad de formar biofilm confiriéndole protección contra antibióticos y frente a la respuesta inmune del huésped. K. pneumoniae sintetiza 8 adhesinas diferentes que le permiten adherirse entre ellas para formar biofilm y al tejido epitelial del huésped. Entre estas adhesinas denominadas fimbrias solo se han estudiado 3 de ellas, de las cuales dos están relacionadas con la formación de biofilm (fimbria de tipo 3 y la fimbria que contiene la proteína estructural EcpA) y la tercera es un factor de virulencia durante las infecciones del tracto urinario (fimbria de tipo 1). En este trabajo se intenta delecionar los genes que expresan las proteínas estructurales repetitivas de las fimbrias no estudiadas para conseguir un mutante por deleción. Los genes que se intentan delecionar de cada fimbria son los siguientes: BN49_1134, BN49_1139, BN49_1533, BN49_2781 y BN49_4961. Además, se intenta introducir el gen GFP en tres mutantes que previamente había construido la doctora Laura Hobley: K. pneumoniae 52145- ∆FimA∆MrkA∆EcpA, ∆MrkA∆EcpA y ∆FimA∆EcpA. Las mutaciones se realizaron mediante el sistema Up+Down que utiliza el grupo de investigación de José Antonio Bengoechea, el cual consiste en dos conjugaciones, cada una con un plásmido diferente: pGPI-SceI y pDAI-SceI. Finalmente, no se consiguió ninguna mutación por deleción pero sí se pudo introducir el gen GFP en el triple mutante. En el futuro, se podría emplear este mutante conseguido para realizar experimentos con Galleria mellonella, estudiando cómo se organiza el mutante en la hemolinfa. Además de poderse llevar a cabo experimentos de virulencia, siempre comparados con un control de K. pneumoniae sin el gen GFP.[eng] Klebsiella pneumoniae is a gram-negative opportunistic pathogen that can cause infections in the urinary tract and pneumonias. In the case of immunocompromised patients, it has a mortality rate of between 25 and 60%. It has been demonstrated to possess several virulence factors, including the ability to form a biofilm, lending it protection against antibiotics and against the host’s immune response. K. pneumoniae synthesises 8 different adhesins that enable it to adhere together to form a biofilm and to the host’s epithelial tissue. Out of these adhesins called fimbriae only three have been studied, two of which are related to the formation of biofilm (Type 3 fimbriae and the fimbriae that has EcpA as structural protein) and one is a virulence factor during urinary tract infections (Type 1 fimbriae). In this study the aim was to delete the genes expressing the repetitive monomers of the unstudied fimbriae in order to obtain a deletion mutant. The genes deleted in each fimbria were the following: BN49_1134, BN49_1139, BN49_1533, BN49_2781 and BN49_4961. Besides, we attempted to introduce the GFP gene into three mutants that had previously been constructed by Doctor Laura Hobley: ∆FimA∆MrkA∆EcpA, ∆MrkA∆EcpA, and ∆FimA∆EcpA. The mutations were brought about through the Up+Down system used by the research group of José Antonio Bengoechea, consisting of two conjugations, each with a different plasmid: pGPI-SceI and pDAI-SceI. Finally, no deletion mutation was achieved but we were able to introduce the GFP gene into the triple mutant. In the future, this achieved mutant could be used to conduct experiments with Galleria mellonella, studying how the mutant arranges itself on the haemolymph. Virulence experiments could also be carried out, providing there is a comparison with a control of K. pneumoniae without the GFP gene