Clonación del sistema CRISPR-Cas de Pseudomonas balearica DSM 6083T en Escherichia coli

[spa] Pseudomonas balearica es una bacteria Gram negativa, aislada por primera vez en aguas residuales de las Islas Baleares, España como un degradador de 2-metilnaftaleno a 40 °C. En el 2016, se publicó el genoma completo de la cepa tipo DSM 6083T y su anotación reveló que contenía un sistema completo CRISPR-Cas tipo I-E, constituido por ocho genes cas, un gen hipotético y dos CRISPR (arrays). Estudios anteriores demostraron la posible funcionalidad del sistema citado en la propia cepa de estudio a nivel de interferencia. No obstante, el aislamiento del sistema en un modelo de estudio más simple como Escherichia coli facilitaría la caracterización del sistema CRISPR-Cas tipo I-E. Así pues, en el presente trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la clonación del locus cas tipo I-E, así como el aislamiento y la clonación del sistema completo CRISPR-Cas tipo I-E con el objetivo de facilitar la caracterización de dicho sistema. La clonación se llevó a cabo en E. coli TOP10 utilizando el TOPO® XL PCR Cloning Kit, construyendo dos plásmidos: el pCRXL-TopoCas y el pCR-XL-TopoCRISPR-Cas. Para la construcción de estos plásmidos se tuvieron que optimizar PCRs largas, teniendo en cuenta que se amplificaron amplicones de 10 kb para el que contenía el locus cas y de 14,7 kb para el que contenía el sistema completo CRISPR-Cas. Con la idea puesta en futuras inactivaciones de los componentes del sistema CRISPR-Cas tipo I-E se aplicó un método de mutación sitio específico basado en intrones del grupo II. Con ello se llevó a cabo la inactivación de un gen no esencial como es el gen lacZ de E. coli BL21 (DE3), demostrando que era un sistema rápido y eficaz en la generación de mutantes de manera sitio dirigida. Por último, con el fin de analizar posibles nuevos CRISPRCas en P. balearica DSM 6083T , se utilizaron nuevos programas de anotación para estos sistemas, como es el CRISPRone. El resultado fue la detección de dos nuevos locus cas aislados cuyos genes pertenecían a los tipos I, IV, V o bien no catalogados. El programa anotó varios genes como hipotéticos, de manera que se llevó a cabo un análisis de estos a nivel de secuencia primaria y secundaria. De todos ellos solo uno pudo ser analizado en profundidad, llegando a la conclusión de que podría ser una nucleasa (similitud con la PaFAN1 de P. aeruginosa), actividad frecuente en las proteínas Cas. En conclusión, este trabajo pone las bases para futuros estudios de funcionalidad y caracterización del sistema CRISPR-Cas tipo I-E de P. balearica DSM 6083T . Se trataría del primer estudio en el que se ha clonado por primera vez un locus cas y un sistema CRISPR-Cas completo tipos I, subtipos E. Así mismo, la clonación en E. coli va a permitir que no interfieran otras proteínas de la propia cepa de P. balearica de estudio como las potenciales Cas detectadas