Diversification patterns and phylogeography in a genus subterranean amphipod (Pseudoniphargus: Melitidae)

[eng] This thesis deals with the phylogeny and phylogeography of the aquatic crustacean amphipod genus Pseudoniphargus Chevereux, 1901, an obligate inhabitant of continental subterranean waters. Special emphasis is placed on the origin of the genus, its extremely disjunct distribution on both sides of the Atlantic as well as in the Mediterranean Sea, and the processes underlying this distribution. Both morphological and molecular approaches are used to investigate the species diversity and detect possible cases of morphological convergence or of recently formed species hidden under cryptisism. Additionally this thesis attempts to place the evolution of the genus in a space-temporal framework by using both fossils and palaeogeographical events as calibration dating points. An ample sampling and collecting effort across the entire known distribution of the genus was undertaken and together with rigorous morphological analysis, molecular data was collected. Sanger sequencing and Next Generation Sequencing (NGS) was utilized to obtain both individual short marker and entire mitochondrial genomes covering all the major clades of the genus. By using four different methods of species delimitation based on mitochondrial cox1sequences, as well as morphology and geographical location we were able to assess the diversity attained by Pseudoniphargus across the vast majority of its current distribution. Several potential cryptic species were encountered, highlighting both the presence of strong morphological convergence and the necessity of using a broad multiple methodological approach to fully investigate species diversification. Two new species are formally described P. morenoi and P. gevi, both from gypsum caves in southern Spain. We used NGS on 31 species covering the major clades and distribution of the genus to recover their mitochondrial genome. The thesis presents a strongly supported, fully resolved phylogeny of the genus Pseudoniphargus identifying four main clades within the genus. By using both fossil data and palaeogeographical events we were able to place the genus in a temporal framework enabling to identify both vicariance and dispersal as contributing processes to explain the current distribution of the genus. Age and origin of the genus is estimated at 55 Ma, consistent with previous investigations and correlates well with the ancient (Eocene) Tethys Sea configuration and its subsequent regression. The mitogenomes also revealed the occurrence of an unprecedented level of gene rearrangements within the genome of various species, up to five, whereupon two of them involved protein coding genesthat is rare event in metazoans, and particularly within a genus. A detailed analysis of the nucleotide and aminoacid composition, and the secondary structure of both RNA and the control region shed light on the molecular patterns of evolution in mitochondrial genomes that in turn are crucial to implement accurate phylogenetic models including mitochondrial sequences. The new mitochondrial genomes presented herein offer an important possibility to establish further comparisons with other amphipods from identical habitats and showing similar distribution patterns to Pseudoniphargus.[spa] Esta tesis investiga el origen y la diversificación del género de crustáceos anfípodos Pseudoniphargus, Chevereux, 1901, exclusivo de aguas subterráneas continentales que presenta una distribución disjunta extrema con representantes a ambos lados del Atlántico Norte. Para ello se realizó un amplio muestreo que ha abarcado el área de distribución completa del género, que ha permitido abordar un riguroso análisis morfológico y genético de 410 especímenes. Mediante el uso de cuatro criterios diferentes de diferenciación de especies basados en un único locus de ADN, combinados con la morfología y la ubicación geográfica, se evaluó la diversidad de Pseudoniphargus a lo ancho de toda su área de distribución. Se demuestra que existe un elevado grado de concordancia entre especies morfológicas y especies definidas con criterios genéticos aunque esta última permitió descubrir varias especies potencialmente crípticas. Además, se describieron dos especies nuevas P. morenoi y P. gevi, ambas descubiertas en cuevas excavadas en yeso en Andalucía. La diversificación de los principales linajes de Pseudoniphagus se ha reconstruido a partir de una filogénia altamente soportada con 4 clados principales asociados a 4 zonas geográficas concretas construida con las secuencias de genomas mitocondriales de 31 especies obtenidas mediante Next Generation Sequencing. La calibración de la filogenia molecular obtenida, una vez detectada la presencia de tasas de substitución heterogéneas, ha permitido identificar tanto a la vicarianza como a la dispersión trans-oceánica como factores que han contribuido a la generación del patrón de distribución actual del género. Según la filogenia molecular elaborada en el presente estudio, el origen del género Pseudoniphargus se remonta a 55 millones de años, siendo esta fecha consistente con estudios previos basados únicamente en caracteres morfológicos de las especies, y que lo asociaban a la regresión de paleo-líneas de costa del Eoceno. El análisis de los mitogenomas obtenidos reveló un alto grado de reordenamiento de genes en varias especies, hasta 5, dos de ellos involucrando a genes codificantes para proteínas. Los genomas mitocondriales presentados brindan una gran oportunidad para establecer comparaciones con otras especies de anfípodos con hábitat y patrones de distribución similares a Pseudoniphargus.[cat] Aquesta tesi investiga l'origen i la diversificació del gènere de crustacis amfípodes Pseudoniphargus, Chevereux, 1901, exclusiu d'aigües subterrànies continentals que presenta una distribució disjunta extrema amb representants a banda i banda de l'Atlàntic Nord. Per a això es va realitzar un ampli mostreig que ha abastat l'àrea de distribució completa del gènere, que ha permès abordar una rigorosa anàlisi morfològica i genètica de 410 espècimens. Mitjançant l'ús de quatre criteris diferents de diferenciació d'espècies basats en un únic locus d'ADN, combinats amb la morfologia i la ubicació geogràfica, es va avaluar la diversitat a Pseudoniphargus a l'ample de tota la seva àrea de distribució. Es demostra que hi ha un elevat grau de concordança entre espècies morfològiques i espècies definides amb criteris genètics encara que aquesta última va permetre descobrir diverses espècies potencialment críptiques. A més, es van descriure dues espècies noves P. morenoi i P. gevi, ambdues descobertes en coves excavades en guix a Andalusia. La diversificació dels principals llinatges de Pseudoniphagus s'ha reconstruït a partir d'una filogènia altament suportada amb 4 clados principals associats a 4 zones geogràfiques concretes que es va construir amb les seqüències de genomes mitocondrials de 31 espècies obtingudes mitjançant Next Generation Sequencing. El calibratge de la filogènia molecular obtinguda, un cop detectada la presència de taxes de substitució heterogènies, ha permès identificar tant a la vicariança com a la dispersió transoceànica com a factors que han contribuït a la generació del patró de distribució actual del gènere. Segons la filogènia molecular elaborada en el present estudi, l'origen del gènere Pseudoniphargus es remunta a 55 milions d'anys, sent aquesta data consistent amb estudis previs basats únicament en caràcters morfològics de les espècies, i que l'associaven a la regressió de paleo-línies de costa de l'Eocè. L'anàlisi dels mitogenomes obtinguts va revelar un alt grau de reordenament de gens en diverses espècies, fins a 5, dos d'ells involucrant a gens codificants per proteïnes. Els genomes mitocondrials presentats brinden una gran oportunitat per establir comparacions amb altres espècies d'amfípodes amb hàbitat i patrons de distribució similars a Pseudoniphargus