Re-Evaluierung, methodische Optimierung und weitergehende Charakterisierung der Empfindlichkeitstestung von Mycobacterium tuberculosis mit dem BacT/Alert 3D (bioMérieux)

Es erfolgte die Re-Evaluierung der Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System (bioMérieux) unter besonderer Berücksichtigung des Materialwechsels der Kulturflasche von Glas auf Plastik. Dazu wurden insgesamt 61 vergleichende MHK-Bestimmungen mit diesen beiden Flaschentypen durchgeführt, wobei sechs Antituberkulotika (INH, RMP, EMB, SM, PTH und MOX) sowie zwölf Mykobakterienstämme (davon neun Mtb.) untersucht wurden. Dabei findet sich kein Unterschied in den MHK-Werten zwischen Glas- und Plastikflaschen. Die Plastikflaschen sind folglich ebenso wie die Glasflaschen zur Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System geeignet. Bei der bisherigen Methode wurde bei der PZA-Testung auf die Verwendung der Kontrollflasche zur Festlegung der Untersuchungszeit verzichtet, weil der erniedrigte pH-Wert ein unverhältnismäßig langsames oder gar fehlendes Wachstum in dieser Flasche bewirkt. Durch Optimierung von pH-Wert (pH 5,9) und PZA-Testkonzentration (200 mg/l) wurde erreicht, dass die PZA-Testung nach der gleichen Methode wie auch bei den anderen Antituberkulotika praktiziert, durchgeführt werden kann. Im weiteren wurde untersucht, wie hoch der Anteil resistenter Mutanten in Mischkulturen sein muss, um erkannt zu werden. Dazu wurden dem sensiblen Stamm H37Rv jeweils isogene Mutanten mit Monoresistenzen gegen INH, RMP oder SM bzw. EMB- und PZA-resistente Stämme in verschiedenen Anteilen zugesetzt. Es zeigte sich, dass ein Anteil von 1% resistenter Stämme noch nicht sicher detektiert wird.The purpose of this paper is to optimize and reevaluate the methods of susceptibility testing of M.tuberculosis with the BacT/Alert 3D System (bioMérieux). The key aspect was the comparison between culture bottles from glass between those made out of plastic material. Therefore 61 comparative MIC-tests were carried out, with six antituberculous drugs (INH, RMP; EMB, SM, PTH and MOX) and twelve mycobacterial strains (nine Mtb.) in order to compare the MIC in the two different bottle types. The MIC of 40 comparative tests between plastic culture bottles were identical to those in glass material. Only 18 test results deviated between the two bottle types. In each of those tests the discrepancy was only one degree of dilution, which is considered as not relevant. Resistant strains were found in three tests, with no difference between glass and plastic bottles. The deviant twelve results of Mtb. strains show a six times higher MIC-value in plastic bottles and a six times lower MIC in plastic bottles. In the case of the substance INH all four discrepant results had a higher MIC in the plastic bottle. Since these results were known by the Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie of the University Leipzig, it was consequently used with good results in the laboratory routine, as well as in external quality control (INSTAND-Ringversuche 2009 to 2011). The second topic of this study was to optimize the current method of susceptibility testing of Mtb. concerning pyrazinamide (PZA). In the current method the low pH of the dilution (5.5) with the resulting weak growth of the strains forced the laboratory assistant to abandon the 1% control bottle as endpoint of measurement. The new and optimized pH of 5.9 and a concentration of PZA of 200 mg/l allows the susceptibility testing of PZA with the same method as practiced for the other antituberculous drugs. Yet another focus of this study was the sensitivity of the BacT/Alert 3D System to detect heteroresistant clones in the mycobacterial broth. Resistant clones and fully susceptible Mtb. strain (H37Rv) were mixed in different percentages and susceptibility testing was performed. It could be shown, that a secure detection of resistant clones is not possible at a percentage 1% of resistant clones in the culture