Phänotypisierung und Genotypisierung von Staphylococcus aureus-Isolaten aus Rohmilchproben Thüringer Milchviehherden

Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger boviner Mastitiden. Die Vielgestaltigkeit der Resistenzmuster und Virulenzfaktoren seiner Stämme macht ihn zu einem Problemkeim aus therapeutischer und prophylaktischer Sicht. Seine Fähigkeit zur Bildung hitzestabiler Enterotoxine verleiht ihm lebensmittelhygienische Relevanz. Mehrfachresistente Stämme stellen gefährliche Zoonose-Erreger dar. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es daher, Aufschluss über Resistenzdeterminanten und Virulenzfaktoren der in Thüringer Milchviehherden vorkommenden Staphylococcus aureus zu erhalten, wobei eine Microarray-gestützte Genotypisierung zum Einsatz kam. Weiterhin sollte analysiert werden, ob der Genotyp der Isolate mit dem Phänotyp korreliert. In 34 Thüringer Milchviehherden wurde der gesamte Bestand der laktierenden Kühe zweimal auf Basis von Viertelgemelksproben bakteriologisch untersucht. Die Beurteilung der Kulturen erfolgte im Nativausstrich nach 48-stündiger Bebrütung und zusätzlich nach Voranreicherung in einer Glucose-Bouillon mit anschließender 24-stündiger Bebrütung. Staphylococcus aureus-positiv waren 1902 von insgesamt 81 567 Milchproben. Aus diesen wurden 189 für die Herden repräsentative Isolate ausgewählt und mittels Microarray-Technologie umfassend charakterisiert und klassifiziert. Zudem wurde der Phänotyp der Isolate auf Äskulin- und Columbia-Blutagar erfasst und das Resistenzverhalten mittels Agardiffusionstest ermittelt. Die 189 typisierten Staphylococcus aureus konnten elf verschiedenen klonalen Komplexen (CC) zugeordnet werden. Der Großteil der Isolate (80,4 %) zählte zu CC133, CC151 und CC479. Diese Isolate besaßen mit einer Ausnahme das Leukozidin-Gen lukF-P83/lukM. Die übrigen Isolate, die negativ auf lukF-P83/lukM getestet wurden, gehörten acht vergleichsweise sporadisch vorkommenden CC (CC7, CC9, CC20, CC45, CC50, CC97, CC101, CC398) an. In nur 0,7 % der zu den drei dominanten CC zählenden Isolate war das Beta-Laktamase-Gen blaZ vorhanden, während es bei 54,1 % der sporadisch vorkommenden CC detektiert wurde. Das Methicillin-Resistenzgen mecA wurde bei lediglich vier Isolaten (2,1 %) nachgewiesen, die alle CC398 angehörten. Sie verfügten neben Resistenzen gegenüber β-Laktam-Antibiotika über eine Tetrazyklin-Resistenz. Darüber hinaus wurde in einem Isolat das Makrolid/Lincosamid/Streptogramin-Resistenz vermittelnde vgaA und in einem Isolat das Aminoglykosid-Resistenz vermittelnde aacA-aphD detektiert. Humanmedizinisch relevante Enterotoxin-, Exfoliatin- oder PVL-Gene wurden in den vier Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) nicht gefunden. Im Agardiffusiontest zeigten diese Isolate eine Penicillin- und eine Tetrazyklin-Resistenz, jedoch keine Resistenz gegenüber Oxacillin, welches als MRSA-Marker gilt. Die Gene der klassischen, humanmedizinisch bedeutsamen Enterotoxine A, B und C waren bei 12,7 % der Isolate vorhanden, wohingegen die Gene von Enterotoxin D und E nicht vorkamen. Insgesamt fanden sich Enterotoxin-Gene bei 78,3 % der typisierten Staphylococcus aureus, wobei die für Enterotoxin G, I, M, N, O und U kodierenden dominierten. Phänotypisch unterschieden sich die CC bezüglich Hämolyse und Pigmentierung, wobei alle CC398-Isolate als eierschalenfarben mit doppelzoniger Hämolyse auftraten. Hämolysin-Gene besaßen alle Isolate, ein Zusammenhang zu den phänotypisch ausgeprägten Hämolysezonen bestand jedoch nicht. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass in Thüringer Milchviehbeständen zwei epidemiologisch unterschiedliche Varianten von Staphylococcus aureus existieren. Die in dieser Studie dominierenden, lukF-P83/lukM-positiven CC133, CC151 und CC479 verursachten einen Großteil der Infektionen und gelten als auf das Euter beschränkte Erreger. Sie können daher als „euterassoziiert“ angesehen werden. Dagegen verfügten die anderen in dieser Untersuchung detektierten, lukF-P83/lukM-negativen CC über Charakteristika „umweltassoziierter“ Keime. Sie besitzen ein breites Wirtsspektrum und treten auch außerhalb des bovinen Euters in der Umgebung der Kühe auf. Die Prüfung auf lukF-P83/lukM erwies sich als zuverlässige Methode, zwischen beiden epidemiologischen Varianten zu unterscheiden. Folglich lässt die An- oder Abwesenheit dieser Genkombination einen Rückschluss auf die in der Herde verbreiteten CC zu. Das ermöglicht die Berücksichtigung der CC-spezifischen Erreger-Eigenschaften bei der Etablierung von Sanierungsprogrammen, die somit effizient gestaltet werden können. MRSA waren in Thüringer Milchviehbeständen wenig verbreitet und nur schwach mit Resistenzdeterminanten und humanmedizinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren ausgestattet. Diese MRSA aus Rohmilchproben sind daher nicht mit multiresistenten Isolaten aus der Humanmedizin zu vergleichen. Gene für humanmedizinisch relevante Enterotoxine, für die ein Zusammenhang mit Lebensmittelintoxikationen belegt ist, wurden selten, andere Enterotoxin-Gene jedoch häufig nachgewiesen