Bioverfügbarkeit des Flavonols Quercetin beim Hund

6 Zusammenfassung Marianne Reinboth Bioverfügbarkeit des Flavonols Quercetin beim Hund Veterinär-Physiologisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2010 79 Seiten, 20 Abbildungen, 6 Tabellen, 211 Literaturangaben, 1 Anhang Schlüsselwörter: Quercetin, Bioverfügbarkeit, Hund, absolute Bioverfügbarkeit, Isoquercitrin, Rutin, Flavonole Für das pflanzliche Flavonol Quercetin werden vielfältige gesundheitsfördernde Wirkungen postuliert, so auch bei Hunden. Über die Bioverfügbarkeit des Flavonols bei dieser Spezies liegen bislang jedoch keinerlei Daten vor. Daher hatte diese Arbeit das Ziel, Bioverfügbarkeit und pharmakokinetische Parameter von Quercetin und wichtigen Quercetinglycosiden bei Hunden nach deren Verabreichung mit einer Testmahlzeit in einer praxisrelevanten Dosierung von 10 mg/kg Körpermasse zu untersuchen. Dazu erhielten 9 adulte Beagles beiderlei Geschlechts das zuckerfreie \"Aglycon\" Quercetin bzw. seine Glycoside Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid) in jeweils äquimolarer Dosierung in einer Testmahlzeit verabreicht. Anschließend wurden Blutproben über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden entnommen und mittels HPLC die Konzentrations-Zeitverläufe der Metaboliten im Blutplasma, die Bioverfügbarkeit sowie weitere pharmakokinetische Parameter bestimmt. Weiterhin wurde die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin aus dem Vergleich einer oralen mit einer intravenösen Applikation bestimmt. Der weitaus größte Teil der Plasmametaboliten von Quercetin sowie seiner beiden Glycoside bestand aus glucuronidierten bzw. sulfatierten Quercetinkonjugaten. Nicht konjugiertes Quercetin-Aglycon kam nur in einem Anteil von etwa 20 % vor. Neben Quercetin machten seine Metaboliten Isorhamnetin und Kämpferol weniger als 10 % aller im Plasma zirkulierenden Flavonole aus. Die absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin betrug nur etwa 4 %. Die relative Bioverfügbarkeit aus dem 3-O-Glucosid Isoquercitrin war mehr als doppelt so hoch wie aus dem Aglycon, die maximalen Plasmaspiegel lagen aber auch hier unter 1 µmol/l. Sowohl nach Aufnahme von Quercetin als auch nach Isoquercitrin kam es zu einer relativ schnellen Absorption aus dem Dünndarm mit einem ersten Plasmapeak ungefähr eine Stunde nach der Ingestion. Vier Stunden nach Aufnahme der beiden Flavonole trat ein zweiter Plasmapeak auf, der in der Regel höher als der erste ausfiel. Dies deutet auf einen enterohepatischen Kreislauf der über die Galle ausgeschiedenen Metaboliten hin. Nach Aufnahme von Rutin kam es zu einer verzögerten Absorption, da eine Deglycosylierung durch bakterielle Glycosidasen im Dickdarm Voraussetzung für die Absorption des Flavonols ist. Maximale Plasmakonzentrationen wurden im Mittel erst 11 Stunden nach Ingestion dieses Glycosids erreicht. Die maximalen Plasmakonzentra-tionen nach Rutin waren geringer als nach Quercetin oder Isoquercitrin, jedoch war die mittlere Verweildauer der Plasmametaboliten mit 18 Stunden auch wesentlich länger. Im Unterschied zu anderen Spezies war die relative Bioverfügbarkeit von Rutin gegenüber Quercetin nicht verringert. Obwohl Rutin eine relativ gute Quercetinquelle für Hunde zu sein scheint, muss bei der Einschätzung möglicher In-vivo-Wirkungen die relativ geringe Bioverfügbarkeit sowie die intensive Metabolisierung seines Aglycons Quercetin berücksichtigt werden.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Funktionen von Flavonoiden in Pflanzen 3 2.2 Biosynthese und Struktur von Flavonoiden 4 2.3 Flavonoidwirkungen im menschlichen und tierischen Organismus 7 2.3.1 Antioxidative Eigenschaften 10 2.3.2 Wirkungen auf Enzyme und Transportproteine des Arzneistoffwechsels 12 2.4 Bioverfügbarkeit und Stoffwechsel des Flavonols Quercetin 13 2.4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin 13 2.4.2 Einfluss des Futters 15 2.4.3 Einfluss des Glycosylierungsmusters 16 2.4.4 Intestinale Absorption und Metabolismus 18 2.4.5 Einfluss der intestinalen Mikroflora 21 2.4.6 Bindung an Plasmaproteine 22 2.4.7 Gewebeverteilung 23 2.4.8 Exkretion 24 2.5 Zielsetzung 25 3 Tiere, Material und Methoden 26 3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 26 3.2 Verwendete Flavonole 27 3.3 Durchführung des Tierversuchs 28 3.3.1 Allgemeine Durchführung der Versuche 28 3.3.2 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 29 3.3.3 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 30 3.3.4 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 31 3.4 Probenaufarbeitung 31 3.5 HPLC 33 3.5.1 Methodenvalidierung und -kalibrierung 34 3.5.2 Berechnung der pharmakokinetischen Parameter 40 3.5.3 Statistische Auswertung 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 42 4.1.1 Quercetin-Aglycon 42 4.1.2 Rutin 46 4.2 Absolute Bioverfügbarkeit Quercetin 48 4.3 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 52 4.3.1 Quercetin-Aglycon 53 4.3.2 Rutin 56 4.3.3 Isoquercitrin 57 5 Diskussion 62 5.1 Zielsetzung der Studie 62 5.2 Methodische Aspekte 62 5.2.1 Auswahl der Versuchstiere und Versuchsanordnung 62 5.2.2 Wahl der Testmahlzeit 63 5.2.3 Einfluss der Zeitpunkte für die Probennahme auf die Berechnung der Verfügbarkeit 64 5.2.4 Analysemethode 65 5.3 Plasmametaboliten von Quercetin 66 5.4 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 69 5.5 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 70 5.5.1 Isoquercitrin 70 5.5.2 Rutin 71 5.6 Bezug der pharmakokinetischen Daten zu potentiellen In-vivo-Wirkungen 73 5.7 Schlussfolgerungen 75 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 9 Anhang 102 9.1 HPLC-Chemikaien 102 9.2 Validierung der HPLC-Methode 103 Danksagung 1097 Summary Marianne Reinboth Bioavailability of the Flavonol Quercetin in Dogs Institute of Physiology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2010 79 pages, 20 figures, 6 tables, 211 references, 1 appendix Keywords: quercetin, bioavailability, dog, absolute bioavailability, isoquercitrin, rutin, flavonols The plant flavonol quercetin is supposed to exert multiple health-related effects in dogs. To date no information on its bioavailability in this particular species is avai-lable. This study intended to investigate bioavailability and pharmacokinetics of quercetin and certain quercetin glycosides in dogs after ingestion of a test meal sup-plemented with a quercetin dose equivalent to 10 mg/kg body weight. Nine adult beagle dogs of both sexes received the aglycon quercetin (sugarfree) or its glycosides isoquercitrin (quercetin-3-O-glucoside) and rutin (quercetin-3-O-glucorhamnoside) in equimolar amounts together with a test meal. Blood samples were taken over a period of up to 72 hours; bioavailability and pharmacokinetics were calculated from the HPLC-derived plasmaconcentration-time-curves. Absolute bioavailability was calculated by comparing an oral to an intravenous administration of quercetin. The majority of analysed plasma metabolites were glucuronidated and sulfated con-jugates of quercetin. Non-conjugated quercetin aglycon comprised only 20 %. Be-sides quercetin, its metabolites isorhamnetin and kaempferol made up less than 10 % of all circulating metabolites. The absolute bioavailability of quercetin was only 4 %. The relative bioavailability of quercetin from isoquercitrin was more than twice as high than from the aglycon, but even there maximal plasma concentrations were generally less than 1 μmol/l. Absorption from the small intestine was rather fast with a first plasma peak after 1 hour after ingestion of quercetin or isoquercitrin. A second, generally higher plasma peak occurred 4 hours after ingestion. This suggests an in-tensive enterohepatic recycling of biliary secreted metabolites. Absorption was significantly delayed after ingestion of rutin due to the necessity of bacterial deglycosilation in the large intestine. Plasma concentrations peaked only after 11 hours. Plasma concentrations after rutin were lower than after quercetin or isoquercitrin, but mean residence time of plasma metabolites was as long as 18 hours after rutin ingestion. Consequently, a once daily feeding of dogs with rutin might lead to relatively constant plasma metabolite concentrations. In contrast to other species, bioavailability from rutin was not smaller than that from quercetin. Although rutin seems to be a relative good quercetin source for dogs, estimations about potential in-vivo-effects of quercetin have to take into consideration its low bioavailabilty and intensive metabolism.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Funktionen von Flavonoiden in Pflanzen 3 2.2 Biosynthese und Struktur von Flavonoiden 4 2.3 Flavonoidwirkungen im menschlichen und tierischen Organismus 7 2.3.1 Antioxidative Eigenschaften 10 2.3.2 Wirkungen auf Enzyme und Transportproteine des Arzneistoffwechsels 12 2.4 Bioverfügbarkeit und Stoffwechsel des Flavonols Quercetin 13 2.4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin 13 2.4.2 Einfluss des Futters 15 2.4.3 Einfluss des Glycosylierungsmusters 16 2.4.4 Intestinale Absorption und Metabolismus 18 2.4.5 Einfluss der intestinalen Mikroflora 21 2.4.6 Bindung an Plasmaproteine 22 2.4.7 Gewebeverteilung 23 2.4.8 Exkretion 24 2.5 Zielsetzung 25 3 Tiere, Material und Methoden 26 3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 26 3.2 Verwendete Flavonole 27 3.3 Durchführung des Tierversuchs 28 3.3.1 Allgemeine Durchführung der Versuche 28 3.3.2 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 29 3.3.3 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 30 3.3.4 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 31 3.4 Probenaufarbeitung 31 3.5 HPLC 33 3.5.1 Methodenvalidierung und -kalibrierung 34 3.5.2 Berechnung der pharmakokinetischen Parameter 40 3.5.3 Statistische Auswertung 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Bioverfügbarkeit von Quercetin und Rutin (je 30 mg/kg KM) 42 4.1.1 Quercetin-Aglycon 42 4.1.2 Rutin 46 4.2 Absolute Bioverfügbarkeit Quercetin 48 4.3 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 52 4.3.1 Quercetin-Aglycon 53 4.3.2 Rutin 56 4.3.3 Isoquercitrin 57 5 Diskussion 62 5.1 Zielsetzung der Studie 62 5.2 Methodische Aspekte 62 5.2.1 Auswahl der Versuchstiere und Versuchsanordnung 62 5.2.2 Wahl der Testmahlzeit 63 5.2.3 Einfluss der Zeitpunkte für die Probennahme auf die Berechnung der Verfügbarkeit 64 5.2.4 Analysemethode 65 5.3 Plasmametaboliten von Quercetin 66 5.4 Absolute Bioverfügbarkeit von Quercetin 69 5.5 Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Quercetinglycoside 70 5.5.1 Isoquercitrin 70 5.5.2 Rutin 71 5.6 Bezug der pharmakokinetischen Daten zu potentiellen In-vivo-Wirkungen 73 5.7 Schlussfolgerungen 75 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 9 Anhang 102 9.1 HPLC-Chemikaien 102 9.2 Validierung der HPLC-Methode 103 Danksagung 10