Characterization of PatA-PatB, a Streptococcus pneumoniae ABC transporter involved in antibiotic resistance

Au cours des dernières décennies, une augmentation non négligeable du phénomène de résistance aux antibiotiques des bactéries a été observée. Ces bactéries possèdent plusieurs mécanismes de résistance parmi lesquels l’utilisation de transporteurs de type MDR (MultiDrug Resistance) dont certains appartiennent à la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette). Les transporteurs ABC sont des protéines membranaires et ubiquitaires qui possèdent une topologie commune avec deux domaines transmembranaires et deux domaines cytoplasmiques. Les transporteurs ABC de type exportateur permettent le transport de molécules à l’extérieur de la cellule en utilisant l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP. PatA-PatB est un transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae, un pathogène humain responsable de pneumonies et de méningites. Cette protéine est impliquée dans la résistance de ce pathogène à des antibiotiques de types fluoroquinolones. Pour étudier son mécanisme moléculaire, nous avons optimisé la surexpression fonctionnelle de ce transporteur chez Escherichia coli. Ainsi, nous avons pu caractériser son activité de transport de drogues et son activité d’hydrolyse de nucléotides. Ces expériences ont révélé que PatA-PatB a la particularité d’utiliser préférentiellement le GTP comme source d’énergie, contrairement aux autres membres de cette famille. Afin d’identifier l’origine de cette propriété au niveau moléculaire, des expériences de mutagénèse dirigée ont été effectuées et nous avons ainsi identifié deux simples mutants qui transportent les drogues aussi bien avec du GTP que de l’ATPThe excessive use of antibiotics during the past decades led to the amplification of multidrug resistance in pathogenic bacteria. Bacteria have developed several mechanisms of antibiotic resistance. One of them involves the antibiotic efflux by MDR (MultiDrug Resistance) transporters, some of which belong to the ABC (ATP-Binding Cassette) transporter family. ABC transporter are ubiquitous membrane proteins with a conserved topology comprising four domains : two «TransMembrane Domain» and two cytoplasmic domains named « Nucleotide-Binding Domain ». ABC exporters expel drugs outside the bacteria using the energy of ATP hydrolysis. PatA-PatB is an ABC transporter from Streptococcus pneumoniae, a human pathogen bacterium responsible for pneumonia and meningitis. This protein is involved in S. pneumoniae resistance against fluoroquinolone antibiotics. To study the molecular mechanism, we optimized the functional expression of this transporter in Escherichia coli. Then, we characterized its drug transport activity and its nucleotide hydrolysis activity. These experiments showed that PatA-PatB, in contrast to other members of the ABC superfamily, preferentially uses GTP as energy supply. To identify the origin of this property at a molecular level, mutagenesis experiments were performed and we identified two mutants capable of an even drug transport with ATP and GT