Phenotypical and molecular characterization of antimicrobial resistant enterobacteria isolated from comercial poultry farms in São Paulo State

Desde a primeira enzima ?-lactamase de espectro estendido (ESBL) detectada, na década de 1980, o número de diferentes enzimas ESBL têm aumentado exponencialmente. Houve também aumento no número de relatos de isolamento de bactérias resistentes presentes em alimentos de origem animal. O objetivo deste estudo foi avaliar enterobactérias de microbiota de frangos comerciais saudáveis, de granjas localizadas no interior do Estado de São Paulo (Brasil), quanto à resistência a antimicrobianos e ao potencial de virulência. Foram avaliadas todas as enterobactérias que apresentaram resistência à cefotaxima e/ou ceftazidima de 200 frangos comerciais para consumo humano. O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado por disco de difusão para diferentes classes de antimicrobianos incluindo ?- lactâmicos e não ?-lactâmicos. Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento foram utilizados para a pesquisa de genes codificadores de ESBL, ?-lactamases AmpC e determinantes de resistência às quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR). A similaridade genética dos isolados foi caracterizada por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e a localização cromossômica ou plasmideal de genes de resistência foi avaliada por I-Ceu IPFGE ou S1-PFGE. Além disso, experimentos de conjugação, tipagem de plasmídeos, investigação de filogenia e de virulência foram realizados. Em todas as amostras de cloaca coletadas foram identificados Enterobacteriaceae, incluindo Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Klebsiella oxytoca e Klebsiella pneumoniae resistentes à cefotaxima e/ou ceftazidima. Salmonella sp não foi detectada. Foi encontrada ampla diversidade genômica entre todos os isolados classificados entre diferentes tipos de PFGE. Foram detectados diferentes genes codificadores de ?-lactamases, a maioria em diferentes plasmídeos, de diversos tamanhos, sendo alguns conjugativos, presentes em diferentes populações bacterianas. Foram identificados isolados de E. coli produtores de CTX-M-2, com inserção do gene blaCTX-M-2 no cromossomo bacteriano. Plasmídeo IncI (ST113/ST114) foi identificado carreando o gene blaCTX-M-8. Foram também encontrados os genes codificadores de ?- ii lactamase, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-15, sendo carreados por plasmídeos. Foi identificado gene blaCMY-2 disseminado por plasmídeos de diferentes grupos de incompatibilidade, na população comensal de E. coli. Nos isolados que abrigavam gene PMQR, além das resistências às quinolonas, foi observado também resistência a outras importantes classes de antimicrobianos. Genes determinantes de PMQR abrigados em plasmídeos tipo ColE foram encontrados em E. coli, E. fergusonii, K. oxytoca e K. pneumoniae. Todas as aves comerciais de granjas localizadas no interior do Estado de São Paulo, incluídas nesse estudo, apresentaram isolados considerados multirresistentes a antimicrobianos e o trato intestinal destes frangos é reservatório dos genes de resistência em enterobactérias da microbiota normal. Além disso, alguns isolados demonstraram alto potencial de virulência, incluindo a capacidade de adesão e invasão em células epiteliais in vitro.of commercial poultry in farms located at the countryside of São Paulo State (Brazil). All enterobacteria presenting cefotaxime and/or ceftazidime resistance from 200 commercial broiler chickens for human consumption were evaluated. Antimicrobial susceptibility testing was performed by disc diffusion for different classes of antimicrobials, including ?-lactams and non-?-lactams. The genes encoding ESBL, ampC ?-lactamases and determinants of plasmid mediated quinolone resistance (PMQR) were screened by polymerase chain reaction and sequencing. Genetic similarity of bacterial isolates was characterized by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and the location of the resistance genes in the chromosome or plasmids was evaluated by I-CeuI-PFGE or S1-PFGE. Additionally, experiments of conjugation, plasmid typing, phylogeny and virulence characterization were performed. Enterobacteriaceae were identified in all cloacal swab samples, including Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae resistant to cefotaxime and/or ceftazidime. Salmonella sp. was not detected. High genetic diversity was detected among all isolates, classified into diferent types of PFGE. Different genes coding for ?-lactamases were detected, harbored in diverse plasmids, of different sizes, some were conjugative and were present in different bacterial populations. E. coli isolates producing CTX-M-2 were identified, harbouring the blaCTX-M-2 gene inserted into the chromosome. IncI (ST113/ST114) plasmid was identified carrying the blaCTX-M-8 gene. The ?-lactamase coding genes, blaCTX-M-2 and blaCTX-M-15 were also found in plamids. The gene blaCMY-2 was found disseminated in different types of plasmid replicons in the commensal E. coli population. In isolates harbouring PMQR genes, in addition to the quinolones resistance, was observed resistance to other important antimicrobials classes was observed. PMQR determinant genes harbored in ColE-like plasmids were found in E. coli, E. fergusonii, K. oxytoca and K. pneumoniae. All commercial poultry from farms located at São Paulo State, evaluated in this study, carried isolates considered multidrug resistant and the intestinal tract of these chickens is reservoir of resistant genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-8 and blaCTX-M-15 in enterobacteria from the normal microbiota. Moreover, some have demonstrated a high virulence potential, with adhesion and invasion capacity in epithelial cells cultured in vitro