Bioanalisis Metabolit Gliklazida dalam Mikrosom Hati Manusia dengan Metode HPLC.

Gliklazida (Gz) adalah obat hipoglikemik oral generasi-2 yang digunakan untuk terapi diabetes mellitus tipe-2.Gliklazida dimetabolisme di liver pada bagian endoplasmik retikulum halus, yang dapat dibuat dalam sediaan mikrosom hati manusia. Mikrosom ini kaya dengan sitokrom P450 (CYP450). Metabolit utama Gz yang terbentuk dalam mikrosom tersebut adalah 7β-OH-Gz, 6α-OHGz, 6β-OH-Gz, dan Me-OH-Gz Metode HPLC metabolit Gz yang pernah ada dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut organik. Pada penelitian ini tidak dilakukan ekstraksi, namun dengan pengendapan langsung hasil inkubasi Gz dalam mikrosom hati manusia menggunakan asam perklorat. Namun tipe kolom, fasa gerak, detektor yang digunakan tidak berbeda (dimodifikasi).Untuk menetapkan kadar keempat metabolit utama tersebut diperlukan metode bioanalisis cuplikan hasil metabolisme Gz dalam mikrosom hati manusia. Menentukan kadar keempat metabolit Gz hasil metabolisme dalam mikrosom hati manusia dengan metode HPLC. Gliklazida dengan kadar 400µM diinkubasi dalam mikrosom hati manusia menggunakan reagen regenerating pada suhu 370 C selama 90 menit. Reaksi inkubasi diakhiri dengan pendinginan tabung pada suhu 40 C dan penambahan 10 µl asam perklorat 70%, sebanyak 10 µl, kemudian ditambahkan larutan baku kerja standar internal klopropamid 200 µM sebanyak 20 µl, dipusingkan 14.000 rpm selama 10 menit, supernatan diambil. Sebanyak 200 µl supernatan ditambah larutan NaOH 2 M sebanyak 5 µl, kocok dan dipusingkan 14.000 rpm selama 5 menit. Supernatan sebanyak 65 µl disuntikkan ke kolom HPLC (Beckman), kolom Ultrasphere ODS 5 µM 4,6 mm x 25 cm, dektektor UV pada 235 nm. Larutan eluen HPLC adalah dapar asetat 5mM (pH 4.3)-Asetonitril (70 : 30), dengan laju alir 1,5 ml/menit. Waktu Retensi 7β-OH-Gz, 6α-OHGz, 6β-OH-Gz, Me-OH-Gz, klorpropamida (IS) dan Gliklazida adalah 4,40; 4,58; 5,55; 7,3; 12,30 dan 36 menit (tanpa mikrosom) dan yang dengan mikrosom hanya 3 metabolit Gz yang terukur kromatogramnya, kecuali metabolit 6α-OHGz. Linieritas, rekoveri, keterulangan, presisi memenuhi syarat untuk penentuan kadar metabolit Gz dalam mikrosom hati manusia. Metode HPLC untuk bioanalisis metabolit utama 7β-OH-Gz, 6β-OH-Gz dan MeOH-Gz merupakan metode yang terpilih dan murah, mudah, cepat serta baik validitasnya