PEMBENTUKAN SEL R.hQ (SACCHAROMYCES CEREVISIAE) GALUR BARU YANG MAMPU MENCERNA PATI SECARA LANGSUNG MENJADI ETANOL MELALUI KLONING GEN AMILASE

Penyisipan gen pengkode amilase ke dalam ragi Saccharomyces cerevisiae ~. mampu meningkatkan fimgsi dan keIja ragi S. cerevisiae daJam mencerna substrat yang lebih murah, yaitu pati secara Iangsung menjadi etanol. Untuk mencapal tujuan tersebut di atas, maka penelitian ini dilaksanakan selama 3 tahun. Pada tahun pertarna (HB VII 199611997) dan tahun kedua (HB V/2 1997/I998) telah dihasilkan 61? transforman dalam Escherichia coli DHSC/.. Selain itu, pada tahun kedua telah pula dihasilkan amplikon lokus gen amlJase (ALP1) yang berukuran sekitar 1400 ph. Amplikon tersebut telah dikarakterisasi dan diinsersikan ke dalam vektor T· pMOSBlue. Pada tahun ketiga penelitian ini, dilakukan analisis adanya insersi gen amilase dalam transforman E.coli DHSa. dengan teknik Direct Screening peR. Kondisi amplifikasi peR yang digunakan sarna dengan kondisi peR pads tahun kedua, yaitu denaturasi pada suhu 11 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA LAPORAN PENELITIAN PEMBENTUKAN SEL RAGI... PUSPANINGSIH, NI NYOMAN T. 94ne selama I menit, annealing pada suhu 50ne selama I menit dan ex/en/Ion pada suhu 72Cse1ama2menit. Jurnlahsiklus adaIah 30 dengan I kali pemantapan ex/en/ion selama 4 menit. Sebagai DNA templat adalah DNA total daIam transforman E.coli DH5a. Sebagai kontrol positif adalah pSFaI dan amplikon (hasil tahun kedua). Selanjutnya, koloni transforman positif dianalisis Iebih Ianjut, meliputi isolasi dan karakterisasi klon serta uji ekspresi ami1ase dengan metode Nelson Somogyi. ....... Hasil Direct Screening peR menunjukkan adanya 3 koloni transforman yang diduga mengandung insert gen amilase. Namun hasil isolasi DNA plasmid dalam skala kecil menunjukkan bahwa ketiga koloni tersebut mengandung DNA rekombinan yang-sl:lfIill.-Selanjumya basil karakterisasi DNA rekombinan tersebut dengan enzim restriksi StuI, HindI dan EcoRl menunjukkan urutan nukleotida daerah insert. Pernotongan dengan enzim StuI menghasi1ak 3 pita yang berukuran ± 5700, ± 3000 dan ± 700 pb.; enzim HindI . menghasi1kan 4 pita yang berukuran ± 3200, ± 2300, ± 2100 dan ± 1800 pb dan EcoRl rnenghasilkan 2 pita yang berukuran ± 700 pb (diduga pada daerah insert) dan ± 8700 pb (diduga pada daerah vektor asaJ YCp50). Pemotongan dengan enzim restriksi . ClaI hanya memberikan 1 pita yang berukuran ± 9400 pb. Ukuran ini lebib besar dan ukuran vektor asa1nya YCp50, sehingga diduga ukuran insertnya adaJah ± 1500 pb. Transforman ini menunjukkan aktivitas amilase sebesar 88,0265 Unit dengan metode Nelson-Somogyi pada A= 748 DID. Basil ini Jebih besar dibandingkan kontrolnya