Production of the antibody against taxol using hemisuccinyltaxol-BSA conjugate

임상병리학과/박사[한글] 본 실험에서는 taxol의 농도를 면역학적 방법으로 측정하는 방법을 확립하기 위한 목적으로, taxol에 대한 단클론 항체를 만들어 보고자 하였다. 분자량이 853 Da인 taxol은 면역원성이 없어 bovine serum albumin(BSA)을 접합시킨 합텐 접합체를 사용하여 taxol에 대한 항체를 제조하였다. Taxol과 BSA를 접합시키기 위해 succinic anhydride를 이용하여 hemisuccinyltaxol을 합성하였으며, 이때 합성 수율은 70% 이었다. 여기에 BSA를 접합시켰으며, 이때 hemisuccinyltaxol-BSA 접합체는 BSA 1 분자당 약 3 분자의 taxol이 결합되어 있음을 UV 분광법으로 확인하였고, 이를 BALB/C mouse에 면역 접종하였다. Hemisuccinyltaxol-BSA 접합체를 항원으로 사용한 ELISA 측정법을 실시하여 면역 접종된 실험동물의 혈청 항체 역가가 1:62,000 임을 확인하였다. 항체가 생성된 실험 동물의 비장세포를 모아 Sp2/0 Ag.14 골수종 세포와 polyethylene glycol(PEG) 1500을 사용하여 두 세포를 융합시켰다. 비장세포와 골수종 세포가 융합한 hybridoma를 선택하기 위해 hypoxanthine, aminopterin, thymidine(HAT)과 3%의 agarose가 포함된 반고체 배지를 이용하였다. 실험 동물에 hemisuccinyltaxol-BSA 접합체를 면역접종 하였으므로 carrier protein인 BSA에 대해 생성된 항체와 taxol에 대해 생성된 항체를 구별하기 위해 표준 taxol 용액을 첨가한 경쟁적 효소면역측정법을 실시하였다 그 결과 1:30,000으로 희석한 혈청에서 1,000 ng의 taxol이 첨가되었을 때 첨가되지 않은 것과 비교하여 UV 홉광도가 0.35에서 0.30으로 0.05만큼 감소하는 것을 확인했으며, 1:10,000으로 희석된 혈청에서는 흡광도가 0.60에서 0.51로 0.09만큼 감소되는 것을 확인하였다. 선별된43개의 hybridoma에서 hemisucciyltaxol-BSA 접합체에 대해서는 높은 반응성을 보이는 반면 BSA에 대해서는 낮은 반응성을 보이는 7개의 hybridoma를 선택하였다. 또한 이들 hybriduma 배양액을 단계 회석함에 따라 낮은 홉광도를 보여준 3G5 hybridoma를 찾을 수 있었다. Hybridoma 3G5의 세포 배양액에 포함된 항체를 사용하여 taxol을 첨가하여 경쟁적 효소면역측정법을 실시하였다. 표준 taxol 1,000 ng이 첨가되었을 경우 hemisuccinyltaxol-BSA 접합체에 결합하는 항체의 결합은 40% 감소함을 보였다. Taxol에 대한 단클론 항체의 생성여부를 확인하기위해 [(125)**I] idotyraminehemisuccinyltaxol을 합성하여 표지항원으로 사용한 방사면역측정법을 실시하였다. 항원 항체 반응에 참여하지 않은 유리 형태의 [(125)**] idotyraminehemisuccinyltaxol과 항원-항체 착물의 분리는 dextran coated charcoal을 이용하였으며, hybridoma 3G5의 세포 배양액에서 27%의 B/T(%) 값을 확인하였고 이때 비특이적 결합 에 의한 방사능은 19% 이었다.Hemisuccinyltaxol-BSA 접합체를 면역 접종한 토끼로부터 얻은 다가 항체를 이용한 sandwich ELISA를 실시한 결과 3G5 hybridoma 세포 배양액 안에서 taxol에 특이적으로 결합하는 항체가 존재함을 확인하였고, 동일한 방법으로 항체의 역가를 확인한 결과 1:128임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 hybridoma로부터 생산되는 taxol에 대한 단클론 항체의 역가를 높이는 실험이 성공하면 taxol의 농도를 정량적으로 측정할 수 있는 면역학적 측정법에 이용될 수 있을 것으로 판단되었다. [영문] Taxol is a natural product extracted from Taxus brevifolia barks, and it is shown to be clinically active against ovalian and breast cancer. Taxol is a potential inhibitor of eukaryotic cell pleliferaction, blocking cell cycle progression at mitosis through its stabilizing actions on spindle microtubles, In this study, the production of hybridoma secreting monoclonal antibodies to taxol is described to establish an immunoassay system for detecting taxol and its analogues in natural extracts and serums of taxol treated patients. Hemisllccinyltaxol was synthesized by esterification of taxol molecule with succinic anhydride with 70% yield. Henlisllccinyltaxol-BSA conjugate was prepared as an immunogen and in the conjugate the molar ratio of BSA to taxol was calculated 1 to 3. Antibody titer of inmmuized mouse serum was determined more than 1:62,000 by ELISA and competitive inhibition ELISA with free taxol reduced to 80% of its abforbance. Splenocytes provided from hyperimnlllnized BALB/C moLlse and Sp2/0 Ag.14 nlyeloma cells fused with PEG 1500 and hybridomas were selected by 3% agarose semisolid medium supplemented HAT. The culture supernatants from hybridoma were assayed for taxol antibody in ELISA coated with hemisuccinyltaxol-BSA. From the assay results, 43 hybridomas were supposed to produce an antibody to taxol. By ELISA using BSA coated plates, 36 hybridomas were ruled out for their reactivity to BSA. By ELISA using a direct taxol coated plate, the 3G5 hybridoma culture supernatant showed the reactivity to taxol. In a competitive inhibition ELISA with 3G5 hybridoma culture supernatant, the absorbance was inhibited to 60% in the presence of 1,000 ng taxol. The culture supernatant of 3G5 hybridoma was performed the RIA to identify the taxol antibody with[(125)**I] iodotyraminehemisuccinyltaxol prepared as tracer. Hybridoma 3G5 producedthe antibody which bound to taxol with 27% B/T ratio in RIA using a [(125)**I] iodotyraminehemisuccinyltaxol tracer then the non-specific bindings were 19% B/T ratio. The rabbit anti-hemisuccinyltaxol-BSA serum was used in sandwich ELISA. When the taxol was used as antigen in sandwich ELISA, the 3G5 hybridoma culture supernatant showed reactivity to taxol. The antibody titer was 1:128 by sandwich ELISA. Prepared 3G5 hybridoma secreting taxol antibody is helpful to establish the immunoassay for semi-quantitative detection for taxol and its analogues.restrictio