Construction and cationic liposome-mediated transfection of adeno-associated virus-based plasmid containing factor IX for gene therapy of hemophilia B

임상병리학과/석사[한글] B형 혈우병은 Ⅹ chromosome에 위치하는 factor Ⅸ 유전자의 결손이나 기능적인 결함에 의해 혈액응고 이상을 나타내는 질환으로, Christmas disease라고도 한다. Coagulation factor 단백질은 체내에서 조절기능이 없기 때문에 factor Ⅸ의 발현이 다른 체내의 요인에 의해 방해받거나 영향을 주지 않고, 조직 특이적 발현의 필요성이 없어 다양한 조직이 유전자 치료의 대상이 될 수 있다. 그리고 혈액 내의 factor Ⅸ의 농도가 조금만 증가되어도 심각한 혈우병 환자의 임상 소인을 경감시킬 수 있다는 장점 때문에 B형 혈우병에 대한 유전자 치료가 연구되어 왔다. Cationic liposome은 중요한 유전자 전달의 도구로 사용되어 왔지만 전달된 유전자의 발현 효율이 viral vector를 사용했을 때보다 상대적으로 낮다는 단점이 있다. 최근의 연구에서 adeno-associated virus ITRs을 가지고 있는 plasmid를 cationic liposome을 이용하여 유전자를 전달했을 경우 효과적인 유전자의 전달과 발현을 보인다는 결과가 보고되었다. 위의 결과를 토대로 효과적이고, 지속적인factor Ⅸ의 발현을 위해 adeno-associated virus ITRs-based plasmid에 human factor Ⅸ 유전자를 재조합하였고, 이를 PCR과 DNA 염기서열 분석을 통해 정확한 위치에 재조합되었는지 를 확인했다. DNA-cationic liposome complex의 가장 효과적인 유전자 전달 조건을 확인하기 위해 pEGFP-N1 plasmid를 사용하였고, green fluorescence protein의 발현 정도에 따라 유전자 전달 효율을 평가하였다. DOTAP/Chol, DOTAP/DOPE, DDAB/DOPE liposome은 1μg DNA 5 nmole liposome 조건에서 가장 높은 발현 효율을 나타냈고, DC-Chol/DOPE liposome은 1μg DNA, 10 nmole liposome을 사용한 조건에서 가장 높은 발현 효율을 나타내었다. 세포주에 따라 다르기는 하지만, 그 중 DOTAP/Chol liposome을 이용한 유전자 전달이 여러 세포에서 가장 높은 효율을 나타냈다. 위에서 얻은 조건에서 293 세포에 pAAVCMV-hFIX를 transfection시킨 후 cellular DNA를 분리하여, 이를 PCR을 통해 분석한 결과 human factor Ⅸ gene이 전달되었음을 확인했다. 그 후 immunoblotting으로 factor Ⅸ의 발현을 확인하였다. [영문] Hemophilia B, Christmas disease, is a chromosome Ⅹ-linked blood clotting disorder resulted from deficiency or functional defectiveness of factor Ⅸ in blood. This disease can be an appropriate target disease for gene therapy because there is no precise regulation of the antihemophilic factor protein and no requirement for tissue-specific expression. In addition, a slight increase of the factor Ⅸ level in plasma can dramatically alleviate the severity of the hemophilia B. Cationic liposomes have been utilized as a gene delivery vehicle for in vitro and in vivo gene transfection. However, relatively low efficiency of the cationic liposomes in gene expression has limited their applications in gene therapy to some extent. Recently a plasmid containing adeno-associated virus ITRs is reported to be more efficient in liposome-mediated gene expression. On the basis of this report, the adeno-associated virus ITRs-based plasmid containing human factor Ⅸ gene was constructed to achieve more efficient and sustained expression of factor Ⅸ. PCR and DNA sequence analysis verified that pAAVCMV-hFIX contained human factor Ⅸ gene in a correct position. Optimal transfection conditions of DNA/cationic liposome complexes were assessed by controling expression of green fluorescence protein after transfection of pEGFP-N1 under various conditions. The optimal ratio of DNA and cationic liposomes for efficient transfection were 1 μg DNA and 5 nmoles DOTAP/Chol, DOTAP/DOPE, DDAB/D0PE liposomes, and 1μg DNA and 10 nmoles DC-Chol/DOPE liposomes at 24-well plate. DOTAP/Chol liposomes were more efficient for gene transfection than any other formulations of cationic liposomes. pAAVCMV-hFIX plasmid was transfected into 293 cells at the most efficient condition for DOTAP/Chol liposomes. PCR analysis and immunoblotting of 293 cells transfected with pAAVCMV-hFIX made it possible to confirm gene transfer and expression of human factor Ⅸ.prohibitio