Antitumor effect of oncolytic adenovirus expressing IL-12 and 4-1BBL in combinati

의과학/박사[한글] IL-12와 4-1BB ligand를 발현하는 종양 선택적 살상 복제가능 재조합 아데노바이러스와 수지상세포 병합치료의 항 종양 효과종양 선택적 살상, 복제가능 아데노바이러스를 이용한 암에 대한 유전자치료 연구가 최근에 활발히 진행되고 있으며, 암 치료에 이용되는 유전자로는 주로 면역 활성화, 혈관형성 억제, 세포 주기의 억제에 관여하는 유전자 등이 있다.대부분의 종양세포는 그 세포막에 공동자극분자의 결핍으로 면역계통의 인지를 피하게 된다. 이러한 종양세포의 면역반응 회피를 극복하기 위하여 여러 가지 공동자극분자 또는 수지상세포 등이 이용되고 있다. CD137(ILA/4-1BB) ligand(4-1BBL)는 활성화된 수지상세포 및 B세포 표면에 있는 공동자극분자인데 4-1BB와 반응하여 T 세포(특히 CD8+) 등의 증식을 거쳐 항암면역을 나타낸다. 또한 전문화된 항원제시세포(antigene presenting cells, APCs)인 수지상세포(dendritic cells, DCs)는 종양에 대한 면역반응에서 innate immunity와 adaptive immunity를 이어주는 연결고리임으로 현재까지 알려진 가장 강력한 암 치료용 세포치료제로써 많이 주목 받고 있다. 그리고 interleukin-12(IL-12)는 강력한 항암면역기능을 가진cytokine으로 알려져 있으며, natural killer(NK) 세포와 lymphokine-activated killer(LAK) 세포, T 세포, 대식세포 등의 세포살상 기능을 높여주는 기능을 한다.본 연구는 아데노바이러스의 E1B55kDa과 E1B19kDa 유전자의 결손 및 E1A 부위의 retinoblastoma 단백질(pRb)과의 결합부위를 변이 시킨 Ad-?E1Bmt7(Ad-?B7) 아데노바이러스를 매개체로 IL-12, 4-1BBL를 발현 시킬 수 있는 복제가 가능한 Ad-?B7/IL12/41BBL가 Ad-?B7, Ad-?B7/IL12 와Ad-?B7/41BBL에 비하여, 그리고 수지상세포와의 병합치료가 각각의 Ad-?B7/IL12/41BBL 단독 치료와 수지상세포 단독 치료에 비하여 항 종양 효과를 더욱 개선할 수 있는지 여부를 규명하기 위하여 계획되었다.IL-12단백질과 4-1BBL의 발현은 ELISA와 Western blotting assay로 확인하였으며, 마우스의 피하 악성흑색종에서 Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스가 Ad-?B7, Ad-?B7/41BBL, Ad-?B7/IL12등 바이러스 보다 종양의 성장을 더 현저하게 억제함을 관찰 하였다(p<0.05, Ad-?B7/IL12/41BBL: Ad-?B7/IL12; p<0.01, Ad-?B7/IL12/41BBL: Ad-?B7/41BBL and Ad-?B7). 이러한 항암기전이 종양에 대한 특이면역반응에 의한 것인지 여부를 검증하기 위하여 마우스 비장세포의 interferon-γ (IFN-γ) ELISpot 분석, 종양 내 IFN-γ 발현 및 cytotoxic T lymphocyte(CTL) 분석을 하였다. 그 결과, Ad-?B7/IL12/41BBL를 이용하여 치료한 마우스에서 다른 대조 마우스에 비하여 종양 내 IFN-γ 발현이 현저하게 증가함과 CTL의 종양특이 세포살상능 증가, 그리고 ELISpot분석을 통하여 비장세포 종양 특이 면역세포의 유의한 증가를 확인하였다. 종양 내 CD4+, CD8+, CD86+, CD11c+ 등 면역세포의 침윤은 IL-12와 4-1BBL를 발현하는 아데노바이러스로 치료한 종양에서 Ad-?B7로 치료한 경우에 비하여 현격하게 증가한 것을 확인하였다.나아가서Ad-?B7/IL12/41BBL 아데노바이러스를 수지상세포와 함께 마우스의 악성흑색종에 투여할 때Ad-?B7/IL12/41BBL바이러스 단독 치료그룹에 비하여, 그리고 수지상세포 단독 치료그룹에 비하여 각각 더욱 개선된 항 종양 효과를 나타내었다. 또한 종양에 대한 특이 면역반응 여부를 검증하기 위하여 비장세포의IFN-γ ELISpot 분석과 종양 내 IFN-γ 발현 및 CTL 분석으로 그 변화를 관찰한 결과, Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스와 수지상세포를 병합하여 치료한 마우스의 비장에서 종양 특이 살상세포의 증가와 종양 내 IFN-γ 발현의 증가, 그리고 종양세포에 대한 특이 살상능의 현저한 증가를 확인하였다. 치료 후 종양조직에는 CD4+, CD8+, CD86+, CD11c+ 등 면역세포의 침윤이 현저하게 증가함이 관찰되었다. 또한Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스와 수지상세포를 병합하여 치료할 때 lymph node로 이동한 수지상세포의 수가 수지상세포를 단독으로 치료할 때 보다 더욱 증가됨을 확인하였다. 마우스 B16BL6 악성흑색종을 이용한 폐 자연전이 모델에서 Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스와 수지상세포의 병합치료 결과, 폐에 암전이가 현저히 억제됨을 확인하였다. 결과적으로 Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스와 수지상세포를 병합하여 치료하는 것이 Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스 혹은 수지상세포를 단독으로 치료한 경우에 비하여 세포 독성면역으로 항 종양 효과가 현저히 개선되는 것을 확인할 수 있었다.종합하면 IL-12와 4-1BBL를 종양 선택적 세포살상, 복제가능 아데노바이러스에 탑재하여 항 종양 효과의 개선을 확인하였다. 그리고 Ad-?B7/IL12/41BBL 바이러스와 종양항원으로 인지시킨 수지상세포를 병합하여 치료하면 Ad-?B7/IL12/41BBL 또는 수지상세포를 각각 단독으로 치료에 사용하는 것 보다 더 강력한 항암 효과 및 암전이 억제효과가 유도됨을 확인하였다.이에 근거하여 결론적으로 IL-12및 4-1BBL를 발현하는 종양선택적 살상, 복제가능 아데노바이러스를 수지상세포와 병합하여 악성흑색종을 치료하는 방법을 실제 환자의 치료에 응용하여 그 치료효과의 유용성 여부를 규명할 필요가 있음을 제안한다. [영문] Oncolytic adenoviral vectors are currently being developed as biological anti-tumor therapeutic agents. A clear benefit of oncolytic adenovirus is amplification of the therapeutic gene expression, as the replicating vector could infect and deliver the therapeutic gene to adjacent cells as well as the first infected cells.Intereukin-12(IL-12) is a cytokine known to enhance the cytolytic activity of natural killer cells (NK cells), lymphokine-activated killer cells (LAK cells), T cells, and macrophages. However, most of tumor cells lack the expression of co-stimulatory molecules on their surface, resulting in escape of recognition by immune system. CD137 ligand (4-1BBL) is a co-stimulatory molecule expressed on the surface of activated T cells. Interaction of 4-1BBL with its own receptor, CD137 (4-1BB) has shown amplification of T-cell (especially CD8+)-mediated anti-tumor immunity. It is already known that DCs are the most potent antigen presenting cells and thus considered as a favorable type of therapeutic cell in cancer immunotherapy.In this study, to increase the potential anti-tumor activity of oncolytic adenovirus, we constructed E1B deleted, and retinoblastoma (Rb) protein binding site of E1A region mutated oncolytic adenoviral vector expressing murine IL-12 and murine 4-1BBL, Ad-?B7/IL12/41BBL. The anti-tumor efficacy of Ad-?B7/IL12/41BBL was evaluated in B16-F10 melanoma bearing immune-competent mice. Significant inhibition of tumor growth was shown in Ad-?B7/IL12/41BBL treated group compared to PBS, Ad-?B7, Ad-?B7/41BBL, or Ad-?B7/IL12 treated groups. We demonstrated that the anti-tumor effect is associated with the tumor-specific immune response; we first quantified the expression level of interferon- γ (IFN-γ) in tumor tissues and examined the cytolytic activity of splenocytes using cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay and IFN-γ ELISpot assay. Furthermore, the infiltrations of CD4, CD8, CD86, CD11c immune cells in tumors were confirmed with immunohistochemistry.Moreover, we also demonstrated the enhanced anti-tumor efficacy of Ad-?B7/IL12/41BBL and dendritic cells (DCs) combinatorial therapy showing a higher incidence of tumor regression compared to an IL-12 and 4-1BBL expressing oncolytic adenovirus alone treated (p<0.05) or DCs alone treated (p<0.01), respectively. Furthermore, we verified strong anti-metastatic potency of Ad-?B7/IL12/41BBL and DCs combination therapy in spontaneous lung metastatic B16BL6 melanoma model. In order to prove that the anti-tumor effects is associated with the tumor-specific immune response, we quantified the expression level of IFN-γ in tumor tissues and examined the cytolytic activity of splenocytes using CTL assay and IFN-γ ELISpot assay. Furthermore, confirmed the infiltrations of CD4, CD8, CD86, CD11c immune cells in tumor through immunohistochemistry. In addition, the number of migrated Green fluorescent protein labeled DCs(GFP-DCs) were augmented in the lymph nodes of Ad-?B7/IL12/41BBL with GFP - DCs combination treatment compared to that of the GFP - DCs alone treatment (p