Rapid detection of isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis isolates using reverse blot hybridization assay

임상병리학과/석사[한글]Isoniazid (INH)와 rifampin (RIF)을 포함한 두 가지 이상의 항결핵제에 내성을 갖는 다제내성결핵 (multidrug-resistant tuberculosis: MDR-TB)의 증가로 결핵균의 약제 감수성 검사 (drug susceptibility test: DST)가 필수적이다. 하지만 기존의 배지에 항결핵제를 첨가하여 감수성 여부를 검사하는 방법은 4～8 주의 오랜 시간을 필요로 하기 때문에 신속한 검사방법의 개발이 필요하다. 이번 논문에서는 항결핵제 내성과 관련된 유전자 내 돌연변이를 분자생물학적으로 검출하는 방법 중 하나인 reverse blot hybridization assay (REBA)를 이용하여 INH 내성과 관련된 유전자 내 돌연변이를 검출함으로써 INH 내성여부를 신속하게 진단하는 방법을 개발하고자 하였다. 이를 위해 2004 년부터 2006 년까지 국립마산결핵병원에 내원한 환자들로부터 얻은 객담 검체 가운데 결핵균 배양검사를 통해 결핵으로 판명된 278 균주를 국립마산결핵병원으로부터 분양받아 이들을 대상으로 INH 내성과 관련된 katG 유전자, inhA 유전자, inhA promoter region, oxyR-ahpC intergenic region, kasA 유전자, 그리고 ndh 유전자 내 돌연변이 유무를 PCR과 염기서열분석을 이용하여 확인하였다. 2004 년에 74 균주를 대상으로 INH 내성과 관련된 유전자 부위의 염기서열분석한 결과 INH 내성 균주에서는 katG 315, inhA 8 nucleotide position (base pairs) upstream of the start codon (UPS)과 15 UPS, 그리고 oxyR-ahpC intergenic region 부위에서 돌연변이가 발견되었다. 전체 INH 내성 균주에서 katG 315에서 64%, inhA 15 UPS에서 18%, 그리고 4%의 내성 균주에서 oxyR-ahpC integenic region에서 돌연변이가 발견되었고, 나머지 14%의 INH 감수성 균주에서는 이들 부위에서 돌연변이가 발견되지 않았다. 이들 3 부위 중 돌연변이 비율이 가장 높은 katG 315 부위와 inhA 15 UPS 부위를 대상으로 probe를 디자인하여 REBA를 개발하였다. 이를 이용하여 2004 년에 82%, 2005 년에 66%, 그리고 2006 년에 69%의 INH 내성 균주를 신속하게 검출할 수 있었다. 또한 katG 315, inhA 8 UPS와 15 UPS, 그리고 oxyR-ahpC intergenic region 부위를 대상으로 probe를 디자인 하여 REBA를 수행할 경우 2004 년의 경우 86%, 2005 년의 경우에는 74%의 INH 내성 균주 검출이 가능함을 확인하였다. REBA를 통해 항결핵제 내성 여부를 확인할 경우 기존의 약제 감수성 검사방법에 비해 하루 내지 이틀 안에 검사 결과 확인이 가능하고, 다른 분자생물학적 검사방법들에 비해 자동화가 가능하여 상용화의 가능성이 높기 때문에 REBA가 기존의 감수성 검사 방법의 단점을 보완하거나 대체할 수 있을 거라 판단된다. [영문]With the increased understanding of the genetic mechanism for drug resistance of Mycobacterium tuberculosis and the advance of molecular technologies in recent years, a number of rapid molecular methods to detect mutations in genes implicated in M. tuberculosis drug resistance have been developed and providing a rapid alternative. This study was set to develop a new molecular method employing reverse blot hybridization assay (REBA) for determination of isoniazid (INH) resistance of M. tuberculosis. In order for the new REBA to be specific and sensitive to detect INH-resistant M. tuberculosis, regions of genes that have been known to be highly related to INH-resistance such as mycobacterial catalase-peroxidase (katG), InhA protein (inhA), alkyl hydroperoxide reductase (oxyR-ahpC intergenic region) and beta-ketoacyl acyl carrier protein synthase (kasA), and NADH dehydrogenase(ndh) have been analyzed. For this study, a total of 278 clinical isolates of M. tuberculosis isolated from Masan National TB Hospital between 2004 and 2006 were used. Among them, 74 clinical isolates of M. tuberculosis were PCR amplified and sequence analyzed for those 5 INH-resistance related genes. In brief, mutations at katG 315, inhA 15 and 8 UPS, oxyR-ahpC intergenic regions were found to be related to INH-resistance of M. tuberculosis clinical isolates. Based on these data, we designed the probes for REBA that can be used to detect the mutations of katG 315, inhA 8 and 15 UPS, and oxyR-ahpC intergenic region. The sensitivity of REBA containing katG 315 and inhA 15 UPS probes was shown to be about 72% and the specificity was 96% when it was used to determine INH-resistance of a total of 278 clinical isolates of M. tuberculosis clinical isolates. In conclusion, from this study, REBA which allows determination of INH-resistance of M. tuberculosis. within one or two working day has been developed.ope