Bile acids analysis by GC-MS and clinical application

임상병리학과/석사기체크로마토그래피-질량분석기(gas chromatography-mass spectrometer, GC- MS)는 GC와 MS가 결합된 분석장비로 GC에서의 체류시간과 MS에서의 mass spectrum을 통해 거의 모든 혼합물의 성분분석이 가능해짐에 따라 분석화학 분야 뿐만 아니라 미량의 정성 및 정량 분석이 요구되는 임상에서 활용도가 증가하고 있는 추세이다. 본 논문에서는 GC-MS를 이 용하여 위액과 혈청내의 담즙산을 분석하여 소화기 질환중의 일종인 역류성 위염과 콜레 스테롤 담석증의 병인을 연구하는데 활용함으로써 임상에서의 유용성을 보여주고자 하였 다. 먼저 이러한 소화기 질환은 담즙산이 관련된 질환으로 GC-MS로 nordeoxycholic acid( NDCA), lithocholic acid(LCA), deoxycholic acid(DCA), chenodeoxycholic acid(CDCA), c holic acid(CA), urthodeoxycholic acid(UDCA)를 정량하였다. GC-MS는 GCMS QP-5000을 사 용하였으며 분석컬럼은 DB-1을 사용하였다. 분석에 앞서 검체를 cholylglycine hydrolase 로 처리하여 결합형 담즙산을 가수분해한 후 위액의 담즙산은 ethyl acetate를 사용하여 추출하였고, 혈청의 담즙산은 Sep-Pack cartridge를 사용하여 추출하였다. 추출한 담즙산 은 5% anhydrous methanolic hydrochloric acid로 esterification한 후 silylation하여 유도화하였다. 표준 담즙산의 mass spcetrum상의 선택이온과 참고이온을 선택하여 5농도 의 표준 담즙산으로 검량선을 작성하여 검체중의 담즙산을 정량하였다. 5종의 담즙산 검 량선의 직선성은 우수하였다(R² > 0.990). 위 절제술 전·후의 위액내의 담즙산 성분을 분석을 하기 위해 위 절제수술을 시행받은 환자 18명을 대상으로 수술 전·후의 위액을 채취하였다. 콜레스테롤 담석증 환자의 소장 통과 시간 측정은 담낭염 및 증상을 동원한 담낭 담석증을 갖거나, 2.5 ㎝ 이상의 무증 상의 담낭 담석증 45명의 환자군과 담낭 용종중 1 ㎝ 이상으로 예방적 담낭 절제술을 시 행받은 7명의 대조군을 대상으로 실시하였으며 UDCA를 경구 복용 후 일정 시간 간격으로 채취된 말초혈액내의 UDCA가 최고치를 보이는 시간을 소장 통과 시간으로 정의하였다. 위 절제술 후에 위액내의 담즙산 농도 변화는 CA는 증가율 83.33% ( p=0.0467), CDCA는 77.78% (p=0.0353), DCA는 77.78% (p=0.0846), LCA는 27.78% (p=0.2977)의 증가된 결과를 보였다. 환자 및 대조군의 소장 통과 시간을 측정한 결과 52명중 혼합 콜레스테롤 담석증은 14명 이었으며 이중 10명이 240분 이상의 소장 통과 시간을 보였다. 결론적으로 GC-MS의 임상에서의 활용이 담즙산 분석뿐만 아니라 기타 미량의 정성 및 정 량 분석에 적용 가능할 것으로 기대되고 GC-MS의 활용도와 유용성이 증가할 것으로 사료 된다. -------------------- 핵심되는말 : 기체크로마토그래피-질량분석기, 담즙산, 역류성 위염, 콜레스테롤 담석증 Gas chromatography - mass spectrometer(GC-MS) is an analysis method combined with GC and MS. The utility has been increased not only in analytic chemistry areas but also in clinical areas needed to analyze micro-compounds, as all the mixed compounds could be analyzed almost with their retention times and mass spectrums. Bile acids analysis by GC-MS and its applications were applied in studies on the pathogenesis of gastric diseases - reflux gastritis and cholesterol gallstone associated with bile acids. Bile acids - nordeoxycholic acid(NDCA), lithocholic acid(LCA), deoxycholic acid(DCA), chenodeoxycholic acid(CDCA), cholic acid(CA), urthodeoxycholic acid(DCA) were analyzed by GC-MS. GCMS QP-5000 and DB-1 were used for quantitation of bile acids. Bile acids in biological fluid was hydrolyzed with cholylglycine hydrolase and unconjugated bile acids in gastric juice and serum were extracted with ethyl acetate and Sep-Pack cartridge respectively. Bile acids extracted was treated with 5% anhydrous methanolic anhydrochloric acid and N,O-bis (tri-methylsily)trifluoroacetamide: trimethyl-chlorosilane(BSTFA: TMCS=99:1 v/v, 1% BSTFA) : N-trimethyl-silylimidazole: pyridine (1% BSTFA : TMSI : pyridine = 3:3:8) for the derivatization. The retention times and the selected ions of bile acids were used for quantitaion. The linearities of calibration curves were excellent (R² > 0.990). Eighteen patients were studied for the exchange of bile acids concentrations in gastric juice after a gastrectomy. Seven controls with gallbladder polyp larger than 1 ㎝ undergone prophylactic cholecystectomy and forty-five patients with cholecystitis or symptomic gallbladder gallstone or asymptomic gallbladder gallstone with larger than 2.5 ㎝ were studied for the measure of small intestinal transit time. Urthodeoxycholic acid was orally administered in the fasting state and serum specimens were obtained successively every 30 minute for 6 hours. The time for the peak of UDCA in the serum was determined the small intestinal transit time. Gallstones of the subjects were obtained from cholecystectomy. The proportions of increased CA, CDCA, DCA and LCA were 83.33% (p=0.0467), 77.78% (p=0.0353), 77.78% (p=0.0846) and 27.78% (p=0.2977), respectively. The mixed cholesterol gallstone patients were 14 out of 52 subjects. The small intestinal transit times of 10 of the 14 patients were prolonged over 240 minutes. In conclusion, the utility of GC-MS could be applicated in clinical areas needed to analyze micro-compounds and its utility and availability would be increased.ope