3'-Methyl-4-dimethylaminoazobenzene으로 유발시킨 백서 간장암 세포 원형질막내 포도당 운반체의 정제 분리

의학과/박사[영문] [한글] 정상 백서 간장 세포와 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene (3'-Me DAB)으로 유도한 간장암세포 원형질막 내 포도당 운반체를 정제 분리하기 위해 사람의 적혈구막에 존재하 는 포도당 운반체를 다음과 같이 정제 분리하였다. 사람 적혈구막을 pH11.5인 알칼리 용액으로 처리하여 protein depleted membrane (PDM) 을 만든 후 46mM octylglucoside로 추출하여 DEAE-Sephacel ion exchange chromatography 를 실시하여 포도당 운반체 활성이 있는 fraction Ⅰ에서 분자량 55kDa에 해당하는 포도 당 운반체를 정제 분리하였으며 이 분획 내 포도당 운반체의 활성도는 4.3pmoles/5min/20 ㎍이었다. 이 단백질을 모아 5∼17% linear gradient SDS-polyacrylamide gel electropho resis (SDS-PAGE)를 실시해 본 결과 분자량 55kDa 주위에서 넓은 단백질대로 나타났다. 이 운반체는 10μM cytochalasin B 존재하에 D-glucose운반 활성이 45% 억제되었다. 이러 한 결과는 본 실험에서 분리한 단백질이 cytochalasin B에 의해 억제되는 포도당 운반체 라는 사실을 시사한다. 이 포도당 운반체를 New Zealand white 토끼에 주사하여 polyclon al 항혈청을 형성시켰으며 이 항혈청 존재하에 포도당 운반체 활성억제도를 측정해 본 결 과 항혈청 양이 200μg일 때 포도당 운반체 활성이 70% 억제되었다. 이러한 사실은 이 항 체가 적혈구 포도당 운반체를 특이하게 억제한다는 사실을 시사한다. 이 항혈청으로부터 protein A-Sepharose CL-4B column을 이용하여 항체를 정제분리하였다. 이 항체를 이용하 여 사람의 적혈구 막 PDM과 이로부터 정제 분리한 포도당 운반체를 전기영동한 후 wester n blot법으로 분석해 본 결과 서로 반응하여 분자량 55 kDa 주위에서 넓은 단백질대로 나 타난다는 사실을 확인하였다. Nitrocellulose membrane에 부착된 항체를 0.1 M glycine ( pH 3.0)으로 유출시켜 모은 후 이 항체를 이용하여 정상 간장 및 3'-Me DAB으로 유도한 간장암 세포 원형질막에 존재하는 포도당 운반체를 western blot법으로 분석해 본 결과 포도당 운반체로 추측되는 분자량 55kDa 근처에서 약한 단백질대가 나타났다. 이런 단백 질대가 나타나는 이유는 정상 간장세포나 간장암세포 원형질막에 면역학적 반응성이 매우 약한 간장형 운반체에 의한 반응이든지 혹은 소량 존재하는 다른 포도당 운반체와 반응 한 결과로 사료되나 어느것이 해당하는 포도당 운반체인지는 본 실험으로서는 확인할 수 없다. 사람의 적혈구형 포도당 운반체에 대한 항체를 Ultrogel AcA22 gel에 결합시켜 aff inity column을 준비한 후 정상 간장 및 간장암세포 원형질막 내 포도당 운반체를 46mM o ctylglucoside로 추출하여 이 추출액 내 포도당 운반체를 정제 분리하였다. 이포도당 운 반체를 western blot법으로 확인해 본 결과 분자량 60kDa에 해당하는 위치에서 포도당 운 반체가 확인되었다. Affinity chromatography법으로 분리한 정상 간장 및 간장암 세포 원 형질막 내 포도당 운반체의 분자량이 55kDa에서 60kDa로 다소 증가되었으며 이는 아마도 순수 정제 분리된 결과로 사료된다. Purification of Glucose Transporter from the Plasma Membranes of Hepatoma Cells Induced by 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene Young Ho Kim Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Yoon Soo Kim, M.D., Ph.D) The present study was attempted to purify the D-glucose transporter (GT) from the plasma membrane of 3'-methyl -4-dimethylaminoazobenzene (3'-Me DAB) induced hepatoma using antibody against human RBC-GT. The D-glucose transporter from human erythrocytes was solubilized from RBC membrane using octylglucoside. The GT in solubilized protein fraction was purified by DEAE-Sephacel ion exchange chromatography. The fraction I was active in D-glucose transport. The transporter activity was 4.3 pmoles/5min/20㎍ protein. 5∼17% Linear gradient SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed a diffuse protein band and a fairly large amount of lipids. The major protein corresponded to the band 4.5 protein. The transporter activity was inhibited by 45% in the presence of 10μM cytochalasin B. This result suggests that the purified protein was a cytochalasin B-inhibitable GT. The antiserum (200㎍) against human RBC-GT also inhibited the D-glucose transporter activity by 70% The anti-RBC-GT antibody in the rabbit antiserum was purified by protein A-Sepharose CL-4B column chromatography. The western blotting revealed that purified antibody showed immunoreactivity with protein depleted membrane and purified GT from human RBC in the band of 55 kDa. Immunoaffinity column was prepared by coupling the antibody to AcA22 Ultrogel. Western blot analysis of plasma membranes from control liver and 3' Me DAB induced hepatoma showed a weak immunoreactivity with anti-RBC-GT antibody in the region of 55 kDa, which suggests that the GT on the liver plasma membrane has a low cross-reactivity with anti-RBC GT antibody. Plasma membranes from both groups were extracted with 46 mM octylglucoside and purified by immunoaffinity column coupled to anti-RBC GT antibody. Western blot analysis of these proteins showed protein bands around 60 kDa region rather than that of 55 kDa. The reason for this discrepancy in molecular weight of GT from plasma membrane fraction and purified glucose transporter is not clear.restrictio