Functional role of Gcn5 on Hoxc11 gene expression in mouse embryonic fibroblast

의과학과/석사Hox 유전자는 동물의 초기 배아 발생 과정 중 특정한 위치와 시간에 몸의 머리-꼬리축을 따라 발현하고 그 부위의 형태를 결정하는 데 관여하는 유전자로 성장과 분화 모든 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이전의 본 실험에서는 Hox 유전자의 상위 조절인자를 찾기 위한 일환으로 Bioinformatics를 통한 in silico 분석에서 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 Gene Expression Omnibus (GEO) dataset GDS1784의 경우 Akt1 (Protein kinase B alpha)이 존재하느냐 안 하느냐에 따라 mouse embryonic fibroblast (MEF)에서 Hox 유전자가 서로 다르게 발현하는 것을 통해 Akt1이 Hox유전자의 상위 조절인자라는 것을 확인한 바 있다. 또한 Akt1은 히스톤아세틸화를 통해 유전자의 발현 조절에 관여하는 대표적인 히스톤아세틸화효소인 General Control Non-derepressible 5 (Gcn5)를 negative하게 조절한다.본 실험에서는 Akt1에 의해 negative하게 조절을 받는 Gcn5가 Akt1의 유무에 따라 다르게 발현하는 Hoxc11 유전자의 발현조절에 어떤 메커니즘을 통해 관여하는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. Wild type MEFs에서 발현하지 않는 Hoxc11유전자가 Akt1이 존재하지 않는 Akt1 null MEFs에서는 발현하는 양상이 히스톤아세틸화에 의한 것인지 확인하기 위해 chromatin immunoprecipitation (ChIP)을 수행하였다. 그 결과 Akt1의 유무에 따라 Hoxc11유전자의 발현이 histone H3K9 acetylation에 의해 조절된다는 것을 확인하였다. 또한 Hoxc11의 발현조절에 Gcn5가 관여하는지 확인하기 위해 Akt1 null MEFs에 Gcn5 siRNA를 처리하여 RNA를 분리한 후 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 Akt1 null MEFs에서 Gcn5가 knock down되었을 때, Hoxc11유전자의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 실제로 Gcn5가 Hoxc11유전자의 histone H3K9 acetylation을 통해 Hoxc11유전자 발현조절에 관여하는지 확인하기 위해 ChIP을 수행하였고, ChIP 결과 Gcn5가 Hoxc11유전자에 직접적으로 결합하여 histone H3K9 acetylation을 통해 발현을 조절한다는 것을 확인할 수 있었다. Gcn5와 Akt1과의 관계를 알아보기 위해 in silico 분석을 통해 mouse Gcn5 아미노산 서열에 Akt1에 의해 인산화될 수 있는 모티프가 존재하는지 확인한 결과 아미노산 서열 272-277에 걸쳐 RQRSQS의 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. Wild type MEFs에서 Akt1과 Gcn5의 interaction이 존재하는지 확인하기 위해 immunoprecipitation (IP)을 수행한 결과 Akt1과 Gcn5 사이에 직접적인 물리적 결합이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.이상의 결과들을 통해 MEFs에서 Gcn5는 Hox유전자의 상위 조절인자인 Akt1과 직접적으로 결합하여 histone H3K9 acetylation을 통해 Hoxc11유전자의 발현을 조절하는 것을 예측할 수 있다.restrictio