(The) role of MMP-2 and MMP-9 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.

의과학사업단/박사[한글] 특발성 폐섬유화는 폐실질 세포의 손상, 염증 반응, 폐포-모세혈관 벽의 심각한 파괴와 섬유모세포의 이동과 증식, 세포외 기질의 침착과 이에 따른 폐 구조의 변형 등의 일련의 과정을 특징으로 하며, 이러한 모든 변화는 기저막을 포함한 세포외 기질을 조절하게 된다. Matrix metalloproteinase (MMPs)는 세포외 기질의 생성, 침착, 분해의 균형을 조절함으로써, 특발성 폐섬유화의 발병 기전에 관련이 있다. 폐섬유화에서 MMP의 역할, 특히 시간적 변화와 MMP 생성에 주된 세포의 역할을 규명하기 위해, 본 연구에서는 백서에 bleomycin을 투여하여 실험적으로 유도된 폐섬유화에서 MMP-2와 MMP-9의 변화를 면역조직화학적 방법과 zymography법을 이용하여 측정하였다. 실험동물을 대조군 (27마리), bleomycin 투여군 (54마리)의 2군으로 나누어 bleomycin 투여 후 제 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일에 각각 실험군 6마리와 대조군 3마리씩을 도살하여 기관지 폐포 세척액에서의 세포수와 염증 세포의 구성비를 평가하였고, zymography를 이용하여 MMP-2와 MMP-9의 활성을 측정하였다. 또한 폐조직에서 면역조직화학적 방법으로 MMP-2와 MMP-9의 발현 정도를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) Bleomycin으로 유도된 폐섬유화에서 세포수는 지속적으로 대조군에 비해 높았는데 초기부터 증가하여 제 4일에 최고치에 이르고, 이 시기에 침윤하는 세포는 중성구와 폐포 대식세포가 가장 많았으며, 중성구는 제 4일에 최고치를 보인 후 급격히 감소하였다. 2) 폐조직에서의 MMP-2와 MMP-9의 면역조직학적 발현은 전체적으로 초기에 급격히 증가하여 제 4일 최고에 도달한 후 지속적으로 감소하였다. MMP-2와 MMP-9은 초기에는 주로 침윤된 염증 세포 즉, 중성구와 폐포 대식세포에서 강하게 나타났으며, 특히 중성구에서는 MMP-9이 강하게 발현되었다. 또 폐포강내 부종액에서도 MMP-2와 MMP-9이 발현되었다. 이런 염증 세포에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현은 제 4일에 가장 현저하였다. 세기관지 상피세포와 활성화된 제 2형 폐포 상피세포에서도 MMP-2와] MMP-9이 발현되었고, 특히 세포 손상의 소견이 있는 경우에는 더욱 뚜렷이 발현되었으며, 이는 비교적 후기까지 유지되었다. 제 7일 이후 섬유화 병소에서는 오히려 MMP-2와 MMP-9의 발현은 상대적으로 감소하였으며 섬유화 병소의 가장자리의 폐포 대식세포와 폐포 상피세포에서의 발현은 유지되었다. 3) 기관지 폐포 세척액에서 zymography로 측정한 MMP-2와 MMP-9의 활성은 역시 초기에 급격히 증가하여 제 4일에 최고치에 이른 후 감소하였으며, MMP-2에 비해 MMP-9이 더 많이 증가하였고 그 변화도 뚜렷하였다. 제 14일에는 활성형의 MMP-2가 미약하게 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하면 bleomycin 유도 폐섬유화에서 MMP-2와 MMP-9은 초기에 침윤한 중성구, 폐포 대식세포 등의 염증 세포와 기관지 상피세포, 제 2형 폐포 상피세포 등에서 다량으로 발현되고 이렇게 분비된 MMP-2와 MMP-9은 폐포의 기저막을 분해하는 등 세포외 기질의 항상성 조절에 불균형을 일으킴으로써 깨어진 기저막 사이로 염증 세포와 섬유모세포 등이 침윤하여 폐포강내 섬유화를 일으키는 초기 섬유화 변화를 유발시키는 것으로 생각된다. 이런 MMP-2와 MMP-9의 발현은 섬유화가 진행되는 단계에 이르면 초기에 비해 감소하지만 섬유화 병소의 가장자리에서 폐포 대식세포와 활성화된 제 2형 폐포 상피세포에서의 발현은 유지되는 점으로 보아 섬유화 병소가 주변으로 파급되는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 또 세포 손상의 소견이 관찰되는 세기관지 상피세포나 폐포 상피세포, 재생과 복구의 일부분으로 생각되는 세기관지화병소와 섬유화병소 가장자리의 제 2형 폐포 상피세포에서 MMP-2와 MMP-9이 발현되는 점으로 보아 폐섬유화에서 상피세포의 손상과 재생에 MMP가 관련이 있다고 생각된다. [영문] Background The pathological processes of the idiopathic pulmonary fibrosis includes a series of sequential events such as parenchymal cell injury, inflammatory response, severe disruption of alveolar-capillary barrier, followed by fibroblast migration and proliferation, and collagen accumulation with the consequent distortion of the lung architecture. All of these changes modulate the extracellular matrix, including basement membrane. Matrix metalloproteinases (MMPs) have been implicated in the pathogenesis of pulmonary fibrosis, by modulating the balance of extracellular matrix production, deposition, and remodeling. To evaluate the role of MMPs, particularly their sequential changes in pulmonary fibrosis, especially in early and late periods, we investigated the change of MMP-2 and MMP-9 in the bleomycin-induced pulmonary fibrosis models in rats. Materials and Methods The level of MMP-2 and MMP-9 in BAL fluid was investigated by zymography in 54 bleomycin-treated and 27 control rats, sacrificed at a given time from 1 to 28 days after intratracheal bleomycin instillation, along with total and differential cell counts of the BAL fluid. We also evaluated the expression of the MMP-2 and MMP-9 in lung tissue by immunohistochemistry. The expression level was estimated semiquantitatively./Results Total cell counts in BAL fluid were significantly higher in the bleomycin-treated group than in control group. It rapidly increased and reached the peak level on the 4th day with neutrophil and macrophage being the predominant cells. The levels of MMP-2 and MMP-9 were markedly increased in both the BAL fluid and in the lung tissue of the bleomycin-treated rats than in controls, especially in the early phase of the pulmonary fibrosis. The MMP-2 and MMP-9 reach their peak levels on the 4th day after bleomycin instillation, then decrease rapidly. The level of MMP-9 in BAL fluid was higher than MMP-2. On 14th day, a small amount of active MMP-2 was noted. In the lung tissue, in the early stage, the two MMPs were predominantly expressed in the inflammatory cells, such as macrophages and neutrophils, the latter being positive exclusively for MMP-9. At the later stage, the inflammatory cell infiltration subsided and the expression of the MMPs in those cells decreased. Fibrotic foci, noted since the 7th day, showed only slight MMP expression, while a few alveolar macrophages and type II pneumocytes at the periphery of the fibrotic foci revealed sustained MMP expression. The bronchiolar epithelial cells and the alveolar epithelial cells were positive for MMP-2 and MMP-9, which is more prominent in those cells with features of cell injury or features of repair. Conclusion These results demonstrate that in bleomycin-induced pulmonary fibrosis, the MMP-2 and MMP-9 may play an important role in the early phase, probably by modulating the extracellular matrix including basement membrane. At the late stage, the MMP-2 and MMP-9 may be involved in the extension and propagation of the fibrotic foci to the surrounding parenchyma. The MMP-2 and MMP-9 also may be involved in the process of cellular repair.ope