Effects of purinoreceptor agonists on intracellular calcium signaling in human nasal epithelial cells

의학과/박사[한글] 코점막 상피는 점액의 대부분을 능동적으로 분비하며, 점막의 과다한 점액분비는 비염, 부비동염 등 다양한 코질환과 밀접한 관계를 가진다. 주로 분비촉진제와 염증매개물의 자극에 의해 점액 등이 분비되는데, 분비촉진제의 대표적인 예로는 세포외 nucleotide를 들 수 있다. 이들 퓨린과 피리미딘은 세포표면의 퓨린성 수용체를 통해 다양한 생리적인 반응을 조절하는데, 현재까지 아홉 가지의 G protein-coupled 퓨린성 수용체와 여덟 가지의 ligand-gated 퓨린성 수용체가 확인되었다. 지금까지 다양한 세포와 조직에서 발현된 P2 수용체에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있으나 코점막 상피세포에서 퓨린성 수용체의 발현에 대한 보고는 매우 미흡한 실정이어서 본 연구에서는 RT-PCR을 이용하여 정상 사람 코점막 상피세포(NHNE 세포)에 발현되는 P2X 및 P2Y 수용체의 mRNA를 확인하고, NHNE 세포의 관내강막과 기저외측막의 칼슘치에 대한 P2X 및 P2Y 선택적 촉진제의 영향을 조사하고자 하였다. 정상 사람 코점막 상피세포를 Yoon 등이 보고한 방법으로 극성을 갖는 단층의 세포로 배양하였으며, 이들로부터 총 RNA를 분리하여 P2X와 P2Y subtype 수용체의 유무를 확인하기 위하여 RT-PCR을 시행한 결과, P2X 수용체 중 P2X3, P2X4는 강하게 발현되었으나 P2X7은 약하게 발현되었고, P2Y 수용체는 P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y11 및 P2Y12가 발현되었다. 또한 이들 발현된 수용체 subtype의 기능성을 확인하기 위하여 수용체에 선택적인 촉진제와 억제제로 자극을 준 후, Fura-2-AM과 miniature Ussing chamber를 이용하여 변화되는 칼슘치를 측정하여 관내강막과 기저외측막에 모두 P2 수용체의 존재를 확인하였다. ATP에 대한 칼슘치의 증가는 P2Y 수용체 억제제에 의해서만 감소되어 대부분의 수용체가 P2Y임을 보여주었고, 세포의 관내강막과 기저외측막을 P2X 수용체의 선택적 촉진제인 α,β-Me ATP과 P2Y1 수용체 선택적 촉진제인 2-MeS-ATP로 전처치한 결과 모두 관내강막과 기저외측막에서 모두 세포내 칼슘치의 변화는 관찰할 수 없어서 기능적 P2X와 P2Y1 수용체의 부재를 간접적으로 알 수 있었다. 또한, UTP, UDP 및 BzATP를 이용하여 NHNE 세포의 관내강막 및 기저외측막에서의 세포내 칼슘치 변화를 분석한 결과, 세포의 관내강막에는 분비와 관계된 기능적인 P2Y2, P2Y6 및 P2Y11이 존재하리라 생각되며, 기저외측 막에는 P2Y2가 중요한 기능을 할 것으로 사료된다. [영문] Extracellular purines (adenosine, ADP, and ATP) and pyrimidines (UDP, UTP) regulate various physiologic responses via cell surface receptors termed purinoreceptors, and may exert autocrine or paracrine effects on ion transport, fluid transport, ciliary beat frequency and mucin secretion. Accordingly, the purinoreceptors in nasal epithelial cells may play an important role in the early stage of secretion under inflammatory conditions. Therefore, we aimed to investigate the expression patterns of purinergic receptors in normal human nasal epithelial (NHNE) cells using RT- PCR, and analyze their localization and functioning on secretion by checking the intracellular calcium levels by Fura-2-AM using various purinoreceptor agonists and or antagonists. In RT-PCR, mRNAs for three P2X (P2X3, P2X4, P2X7) and five P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y11, P2Y12) receptors were expressed. In localization using ATP, caffeine and PPADS, P2 receptors were confirmed to present in both luminal and basolateral sides of NHNE cells. We analyzed the roles of functional P2X4, P2X6 and P2Y1 receptors using α,β-Me ATP as a P2X agonist and 2-MeS-ATP as a P2Y1 agonist. Our results suggested that all three receptors were not functionally active as far as the secretion is concerned. Then, we performed functional study for P2Y receptors in NHNE cells using ATP, UTP and UDP. Our results indicated that P2Y2 and P2Y6 receptors are present in luminal side, but there is only P2Y2 receptor in basolateral side of NHNE cells. In the last functional study on P2Y11 using BzATP and caffeine, our data indicated that P2Y11 receptor may be present only in the luminal membrane of NHNE cells. In conclusion, our results may suggest that NHNE cells have P2Y2, P2Y6 and P2Y11 receptor related to the function on secretion.prohibitio