Cloning of major antigen of Entamoeba histolytica and serodiagnosis of amoebiasis using a recombinant protein.

의학과/박사[한글] 이질아메바는 음식물이나 식수를 통하여 감염되는 인체기생원충으로 이 원충에 의해 발병되는 이질아메바증은 설사 및 간농양 등을 일으키는 중요한 감염 질환이다. 본 연구의 목적은 우리나라에서 분리된 이질아메바를 재료로 중요 항원물질을 분석하고, 이들의 유 전정보를 밝히며, 또한 이질아메바 특이 항원결정부위를 포함하는 재조합 단백질 조각을 얻어서 이질아메바증의 면역 진단에 응용하는 것이다. 무균 배양하고 있는 이질아메바로 추출액을 제조하여 ion exchange (DEAE-Sepharose와 Resource Q)와 gel filtration (Superdex 200) 크로마토그래피를 통하여 분획하고, 감염 혈청과 반응시킨 결과, 31, 62, 97 kDa의 중요 항원을 분리하였다. 분리된 항원 단백질에 대한 유전정보를 밝히기 위해, 이질아메바의 cDNA library를 제조하였다. 한편, 각 항원 분획을 BALB/c 마우스에 3차 면역하여 polyclonal antibody를 만들고, 이 마우스 면역혈청 및 이질아메바 감염혈청으로 이질아메바의 cDNA library(6 X 10^5의 plaque)를 면역 선별하였다. 면역 선별로 각 중요 항원 단백질을 발현하는 클론을 얻었으며, DNA sequencing을 한 후, GenBank에 보고된 정보와 비교 분석한 결과, 31 kDa의 항원 단백질은 숙주 조직에 침투할 때 활성산소의 공격에 대한 방어에 관여하는 것으로 알려진 alkyl-hydroperoxidase reductase인 것으로 밝혀졌으며, 62 kDa 항원 단백질은 이질아메바에서 중요한 항원으로 알려진바 있는 alcohol deh ydrogenase 3로 밝혀졌다. 그러나 97 kDa 항원 단백질에 대한 유전자는 면역 선별로 찾지 못하였다. 이 중 사람 감염혈청에 강한 양성을 보인 클론 12개 중 9개(75%)의 클론이 coding 하고 있는 alkyl- hydroperoxidase reductase cDNA를 제한 효소(Mse I) 처리 및 PCR 수행하여 특이 항원결정부위 mapping을 실시하였다. 그 결과 아미노산 서열 14-51 부위에 항원결정부위가 있음을 알 수 있었다. 이 항원결정부위를 포함한 재조합 단백질 조각을 대장균에서 과발현시킨 후, 이를 사용한 면역이적 및 ELISA로 항원성을 검증하였다. 다른 원충성 기생충 질환, 즉 람블편모충증 및 톡소포자충증 양성혈청과의 교차반응을 관찰해 본 결과, 특이도와 민감도가 각각 100%와 92%이었다. 이 결과로 이질아메바 alkyl-hydroperoxidase reductase의 항원결정부위를 포함한 재조합 단백질 조각이 이질아메바증의 면역진단에 유용함을 알 수 있었다. [영문] Entamoeba histolytica is a major cause of morbidity and mortality worldwide. The causative agent, the intestinal protozoan parasite E. histolytica, probably infects more than 500 million people, resulting in an estimated 50 million cases of diarrhea and liver abscess and 40,000 deaths annually. To develop an improved serodiagnostic test for amoebiasis, we performed a detailed analysis of a major antigen for E. histolytica Korean strain YS-27 and analysed the immunodominant protein fragment containing E. histolytica specific epitopes. We performed a detailed analysis of the immunodominant epitopes of a major antigen, alkyl-hydroperoxide reductase, and evaluated its sensitivity and specificity. ELISA based on the fragment containing the immunodominant epitope was evaluated further and compared with full-length recombinant alkyl-hydroperoxide reductase. Specificity and sensitivity of the two ELISAs were assessed using 55 human sera of parasitic protozoa infection cases (25 amebiasis, 20 giardiasis and 10 toxoplasmosis sera) and 10 healthy control sera. The immunodominant epitope of the alkyl-hydroperoxide reductase is localised only in the N-terminus 14 to 54 amino acid residues. The sensitivities of the two ELISAs were very high, 92% and 96%, respectively. The specificity of the fragment was 100%, whereas the specificity of the full-length alkyl-hydroperoxide reductase was 86.6%. These results indicate that the fragment containing the immunodominant epitope of the alkyl-hydroperoxide reductase can be used to accurately serodiagnose amebiasis without cross-reactivity from other parasites.ope