Expression of Bcl-2 gene family in leukoplakia and squamous cell carcinoma of oral mucosa

치의학과/석사[한글]구강점막은 암종으로 진행되는 과정 중 육안적으로 관찰 가능하고 광범위한 백반증이 나타난다는 점에서 다단계 발암과정을 관찰할 수 있는 유용한 모델이다. 따라서 구강내에서 가장 흔히 발생하는 편평세포암종의 발생 단계에서 그 위험도를 평가할 수 있는 생물학적 표지자를 찾는 것은 종양 발생과 예후평가에 중요한 의미가 있다. Apoptosis는 세포의 발생과 분화, 성장, 노화의 전 과정을 통해 일어나 항상성을 유지하게 하는 정상적인 세포 사멸 과정으로서 비정상적인 apoptosis의 조절은 암 발생 단계의 특징적 양상이다. Bcl-2는 apoptosis를 조절하는 대표적 유전자이며, apoptosis를 억제하는 Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 등과 apoptosis를 촉진하는 Bax, Bcl-Xs, Bid, Bak 등의 두 가지 상반된 기능을 가지는 구조적으로 유사한 여러 유사체와 함께 유전자군을 이루고 있다. 특히 Bcl-2와 Bcl-XL은 강력한 apopotosis 억제자로서 여러 가지 종양의 발생에 관여한다. 그러나 두경부의 다단계 발암과정에서 이들 유전자의 관여 여부는 아직 정확히 알려져 있지 않다. 이 연구는 암 발생 단계와 편평세포암종에서의 Bcl-2 유전자군의 관여 여부를 알아보고자 연세대학교 치과대학 구강병리학교실에 생검 의뢰된 조직 중 백반증 27예, 편평세포암종 36예, 정상점막 5예와 본 실험실에서 확립한 9가지 구강 암종 세포주를 대상으로 Bcl-2, Bcl-XS/L, Bax에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색과 Western blot을 시행하여 다음과 같은 연구 결과를 얻었다. 1. 면역조직화학 염색을 이용한 조직절편에서 Bcl-2 단백은 정상, 백반증, 암종 병 소에서 발현되지 않았으며 구강암 세포주에서도 세포주 염색, Western blot 결 과 모두 음성으로 나타났다. 2. Bcl-XS/L는 정상 점막과 백반증에서는 기저세포층에 발현하였고 이형성이 심한 부위에서는 상층부의 세포에서도 발현하였으며, 암종이 진행될수록 발현이 증가 되는 양상을 보였다. 3. 배양한 구강 암종 세포주는 면역조직화학 염색에서 핵주변의 세포질에 뚜렷하 게 Bcl-XS/L에 대해 양성 반응이 나타났다. Western blot의 결과, 정상 세포에 서는 Bcl-Xs가 더 많이 발현을 하였고 암 세포주에서는 주로 Bcl-XL이 발현되 었다. 4. Bax는 정상점막에서 극세포층에서만 미약하게 발현하였고 이형성이 없이 상피증식만 있는 백반증의 극세포층에서 발현이 증가하였으나 대부분의 암종 에서는 Bax가 관찰되지 않았으며 분화가 좋아 각질을 형성하는 부위에서만 일 부 발현되었다. 배양한 구강 암종 세포주에서 Bax는 발현되지 않았다. 이상의 결과를 종합하면 apoptosis를 조절하는 유전자로 알려진 Bcl-2 단백은 구강 편평세포암종 발생 단계에서 발현하지 않으며 apoptosis를 촉진하는 유전자인 Bax는 구강점막의 각화세포 분화에 관여한다고 생각하였다. Bcl-XS/L은 암 발생 진행 단계에 따라 점차 발현이 증가하여, 이는 apoptosis를 억제하는 Bcl-XL의 발현 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. 따라서 구강 편평세포암종의 발생에 Bcl-XL이 Bcl-2의 역할을 대신한다고 할 수 있으며 구강 점막 전암병소의 예후를추적할 수 있는 생물학적 표지자로 사용할 수 있다고 생각한다. [영문]Oral mucosa is a useful model which enables us to observe the multi-stage carcinogenesis. Thus, it is meaningful to find out a biomarker which helps to evaluate the prognosis of oral premalignant lesions. Apoptosis is a physiologic process which permits cell turnover and is critical for the maintenance of homeostasis in tissues. Bcl-2 is known to be key regulator of apoptosis and constitutes gene family of many structural homologues dividing into anti-apoptotic protein Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 and pro-apoptotic protein Bax, Bcl-Xs, Bad, Bak. Two family members in particular, Bcl-2 and Bcl-XL function as potent inhibitors of apoptosis and have been implicated in a number of human cancer. However the relative expression of these family members in head and neck multistage carcinogenesis has been controversial. In this study, 27 cases of leukoplakia, 36 squamous cell carcinomas and 5 normal mucosas were obtained from the files of the Department of Oral Pathology of the Dental Hospital of Yonsei University. The immunohistochemical staining and Western blot analysis with the paraffin sections and established oral cancer cell lines were performed using antibodies of Bcl-2, Bcl-XS/L, Bax. The results were as follows : 1. Bcl-2 protein did not express in normal, leukoplakia and cancer tissue sections as well as the established cancer cell lines 2. Bcl-XS/L protein was expressed in the cytoplasm of basal cell layer for normal mucosa and leukoplakia and also frequently appears in upper cell layer for severe dysplasia. Also overall up regulation of Bcl-XS/L protein was identified during the progress of carcinoma. 3. Immunostaining on the oral cancer cell lines with Bcl -XS/L resulted in expression of the protein in most of cancer cell lines. Especially it was markedly expressed at the perinuclear cytoplasm. Western blot analysis showed that normal cell express Bcl-Xs, while tumor cells express Bcl-XL. 4. The expression of Bax protein was confined in prickle cell layer for normal mucosa and increases in prickle cell layer of leukoplakia showing hyperplasia. Neither immunohistochemical stain nor western blot analysis showed Bax expression in established oral cancer cell lines. These observations suggest that Bcl-2 protein is not expressed in the development of oral squamous cell carcinoma, and Bax is believed to participate in the differentiation of oral keratinocyte. Bcl-XS/L expression was related to the progression of malignancy. These data suggest that Bcl-XL carries out anti-apoptotic functions instead of Bcl-2 during the development of oral squamous cell carcinoma, and may be valuable as the biomarker to inform the oral cancer progression.ope