Studies on the morphological changes of neurons in dorsal root ganglion of the rat with an experimental peripheral neur

의학과/박사[한글] 말초신경 손상 후 빈번히 발생하는 만성적인 동통증후군의 하나인 작열통(causalgia)의 발생 기전은 아직 확실하게 알려져 있지 않다. 그러나 최근에 와서는 말초신경의 손상으로 인한 말초신경질환의 동물모델이 개발되었으며, 이에 대한 여러 가지 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 말초신경의 손상에 의한 신경병성 동통증후군 모델의 하나인 Kim과 Chung와 모델을 사용하여, substance P, CGRP, serotonin, norepinephrine 등 신경전달물질과 통각신경활성의 지표로 사용되는 원종양유전자인 c-fos의 변화를 이들을 항원으로 하는 면역조직화학적 방법과, 전자현미경 관찰 및 영상분석기를 이용한 형태정량적 방법으로 연구함으로써 신경의 손상으로 인한 만성동통증후군에서의 신경전달물질의 변화를 밝히고자 본 실험을 시도하였다. 신경병성 통증의 유발은 제5 및 제6요수신경(L5 and L6 spinal nerves)을 결찰하여 병변을 유발하였고, 수술 후 24시간 후와 1주일 후 실험동물을 회생시켜 CGRP와 substance P를 항원으로 하는 면역조직화학적 염색을 시행하였다. C-fos 단백질은 신경결찰 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 1주 후 역조직화학염색을 시행하였다. 광학현미경으로 관찰한 후, 척수후근신경절의 substance P와 CGRP에 양성반응을 보이는 신경원의 수를 계수하였고, 척수후각의 c-fos 함유 신경원은 천충(Rexed 충판 Ⅰ, Ⅱ)과 심충(Rexed 충판 Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ)으로 구분하여 계수한 후 그 결과를 통계 분석하였다. 전자현미경 관찰을 위해 substance P, CGRP 항체에 면역세포화학염색된 표본과 일반 전자현미경 표본은 Philips 또는 Hitachi 전자현미경을 사용하여, 변화된 양상을 관찰하였다. 실험 결과는 다음과 같다. 1. 신경병성 통증이 유발된 흰쥐에서 유발한 쪽 척수신경절의 substance P와 CGRP 면역반응 양성 신경원의 수는 손상 후 24시간에는 약간 감소하는 소견을 보였으며, 손상 1주일 후에는 크게 감소하였다. 2. 신경병성 통증을 유발한 쪽 척수 후각의 천충에서 c-fos 단백질의 활성도는 2시간 후에 최대로 증가하다가 점차 감소하여 1주일 후에는 정상으로 회복하는 양상을 나타내었다. 3. 신경병성 통증을 유발한 쪽 척수 후각의 심층에서 c-fos 단백질의 활성도는 점차적으로 조금씩 증가하여 24시간 후에 최대치를 보였고, 1주일 후에는 정상으로 회복하는 경향을 보였다. 4. 전자현미경에서는 일부 신경세포와 축삭들이 퇴행성변화를 보이는 경우가 관찰되었다. 이상의 결과로 미루어보아 신경병성 통증 실험모델 흰쥐에서 손상 초기에는 척수 후각의 천충에서 c-fos 단백질의 활성도가 높아지며, 다음에는 척수 후각의 심층에서 높아지고 그 후에는 substance P와 CGRP 등 통각전달에 관여하는 신경전달물질이 크게 저하된다고 결론지을 수 있었다. [영문] Animal models for human chronic pain syndromes were developed and widely used for pain research. One of thsese neuropathic pain model by Kim and Chung(1992) has many advantages for operation and pain elicitation. We have examined the c-fos protein, substance P, CGRP iminunoreactivity in dorsal root ganglia and dorsal horn in this neuropathic model. About 50 Sprague-Dawley rats were used for this study. L5 and L6 spinal nerve were ligated tightly to produce neuropathic pain model. After 2, 4, 8, 16, 24 hours and 1 week of surgery, rats were anesthesized and sacrificed by perfusion through the left ventricle with saline followed by 0.1 M phosphate buffer(pH 7.4) containing 3% paraformaldehyde, 3% glutaraldehyde, and 0.1% picric acid. After confirmation of the roots transected by the surgery, the L5 and L6 dorsal root gang1ion and spinal cord were removed and processed for immunohistochemistry. All tissue sections were immunohistochemically stained for substance P, CGRP and c-fos by using the peroxidase-antiperoxidase(PAP) method. For electron microscopy, the stained tissue was thoroughly rinsed in phosphate buffer and placed in 1% osmium tetroxide in 0.1 M phosphate buffer for 30 minutes. The tissue was then rinsed in maleate buffer(pH 6.0), stained with uranyl acetate in maleate buffer, rinsed, dehydrated, and embedded with EPON-araldite mixture. Selected areas of the dorsal horn were trimmed and mounted on an EPON chuck with a drop of EPON. The thin sections were cut and mounted on the copper grids and viewed without lead citrate staining with a Philips or Hitachi electron microscope. Count the number of immunostained substance P and CGRP dorsal root ganglion cells and c-fos immunoreactive dorsal horn cells and analyzed statistically with Mann-Whitney U test. The results are as follows: 1. The number of c-fos protein immunoreactive neurons in the superficial layer of dorsal horn were increased markedly at 2 hours after operation, gradually decreased to normal level 1 week after operation. 2. The number of c-fos protein immunoreactive neurons in the deep layer of dorsal horn were gradually increased to the peak 24 hours after operation, decreased to normal level 1 week after operation. 3. The number of substance p and CGRP immunoreactive L5 and L6 dorsal root ganglion neurons were decreased markedly at 1 week after pain model operation. 4. Some degenerative profiles were found in electron microscopy. In conclusion, after neuropathic pain model operation, c-fos protein were immediately expressed in the superficial layer of spinal dorsal horn, thereafter c-fos protein in the deep layer of spinal dorsal horn were expressed. CGRP and substance P immunoreactive neurons were decreased markedly 1 week after neuropathic pain model operation.restrictio