A homeotic protein, Hoxc8, regulates the expression of proliferating cell nuclear antigen (Pcna)

의과학과/석사[한글] Hoxc8은 발생을 조절하는 유전자 중의 하나로 발생 과정에서 몸통의 전, 후 축을 따라 특이적으로 발현한다. Homeodomain은 183 bp의 DNA 염기서열인 Homeobox가 암호화 하고 있는 61개의 아미노산이며, 이를 갖고 있는 Hox 단백질은 특이적인 DNA 서열을 인식하고 결합하는 전사조절인자(transcription factor)로 알려져 있다. 전사조절인자인 Hox 단백질은 하부 유전자들과 결합하고, 그들의 발현을 조절하며 발생 과정에 관여하게 된다. 이전의 본 실험실에서는 Hoxc8이 조절하는 하부 유전자를 밝혀내기 위해 프로테옴 분석 방법을 이용하였고, 그 결과 cyclin이라고도 불리는 proliferating cell nuclear antigen (Pcna)의 발현이 Hoxc8을 과발현 시킨 F9 murine embryonic teratocarcinoma 세포에서 조절되는 것을 확인한 바 있다. Pcna는 DNA 복제, DNA 수선, 세포 주기 조절과 chromatin structure remodeling 등에 관여하는 유전자이다.본 실험에서는 Pcna가 Hoxc8의 조절을 받는 downstream target gene인지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 시행하였다. Hoxc8과 Pcna의 발현 양상을 분석하기 위해 11.5일 된 생쥐 배자를 전, 후 축을 따라 절단하여 각각 RNA를 분리한 후 RT-PCR을 수행하였고 그 결과 Pcna의 발현 패턴은 Hoxc8과 유사한 것처럼 보였다. 또한 7.5부터 17.5일까지의 생쥐 배자에서 RNA를 분리하여 Real-Time PCR을 수행한 결과 Hoxc8과 Pcna가 거의 모든 시기에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다. Pcna 유전자의 발현이 직접 Hoxc8의 영향을 받는지 확인하기 위해 C3H 10T1/2 세포에 pcDNA:Hoxc8과 pcDNA3.0 vector를 transfection 한 다음, RNA를 추출하여 RT-PCR과 Real-Time PCR을 수행한 결과 Hoxc8을 과발현 시킨 세포에서 Pcna의 발현이 1.5배 정도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Pcna의 upstream region의 염기서열을 분석한 결과 Hox core binding site가 많이 보존되어있는 것을 확인할 수 있었다. 실제로 Pcna의 upstream에 Hoxc8이 결합하는 지 확인하기 위해 chromatin immunoprecipitation (ChIP)을 수행하였고, ChIP 결과 Hoxc8이 Pcna의 upstream에 직접적으로 결합하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 Pcna가 in vitro system에서 Hoxc8에 의해 조절되는지 확인하기 위해 Pcna의 upstream region 약 2.4kbp를 luciferase reporter vector인 pGL3-basic vector에 클로닝하여 luciferase assay를 수행하였고, Hoxc8을 과발현 시킨 세포에서 Pcna의 promoter가 reporter의 activity를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. Luciferase assay 결과는 앞서 해 온 실험과 반대되는 것으로, 그 이유를 알아보기 위해 Pcna upstream의 in silico 분석을 하였고 그 결과 Pcna의 upstream region에 noncoding RNA인 AK007836과 promoter region에서 유전자의 발현 양상에 관여하는 CpG island가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 연구에서 Pcna가 Hoxc8의 조절을 받는 downstream target gene이라고 예측할 수 있다. [영문]restrictio