Enhanced anti-tumor effect of oncolytic adenovirus expressing IL-12 and GM-CSF

의과학과/박사[한글] 증식 불능 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료는 감염된 세포에서만 치료 유전자가 발현되어 그 효과가 일시적이라는 단점 때문에 사용에 많은 한계가 있었다. 이러한 단점을 극복하고자 암세포에서만 세포 살상효과를 나타내는 종양 특이적 살상 아데노바이러스를 제작하였으며 이는 암세포 내에서 자가 복제하여 주변으로 확산하여 항종양 효과를 증대시킬 수 있을 뿐 아니라 기존의 증식 불능 아데노바이러스보다 유전자 전달 효율이 우수한 것으로 알려져 있다. 최근에 급속한 세포 면역학의 발달로 항암 면역반응에 관여하는 세포들과 그 작용 기전들이 밝혀지고, 특히 여러 암세포 표면에서 면역반응을 일으키는 종양 항원들이 보고됨에 따라 암의 면역학적 치료에 보다 많은 관심을 갖게 되었다. 여러 가지 사이토카인 중에서 IL-12는 cytotoxic T lymphocytes(CTL) 및 NK 세포에 직접 작용하여 IFN-γ의 분비를 촉진시켜 NK 세포의 세포 용해능력(lysis activity)을 증강시키고 Th1 면역반응도 증진시킴으로써 면역반응을 활성화하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 암의 전이를 억제하는 데도 중요한 역할을 한다. 또한, GM-CSF는 dendritic cell(DC)의 분화와 성장을 조절하는 사이토카인으로써 T 세포들의 면역반응을 강화시켜 주는 역할을 한다. 이러한 배경 하에 본 연구에서는, 아데노바이러스의 초기 유전자인 E1B 19와 55 kDa이 소실되고 pRb의 결합능이 소실되어 암세포 특이적 증식가능 아데노바이러스를 유전자 전달 매개체로 이용하여, 암세포에 대하여 강한 면역반응을 유도하는 IL-12와 GM-CSF를 종양세포 특이적으로 고발현시켜 암세포에 대한 살상 효과의 개선 여부를 검증하고자 하였다. 먼저, IL-12와 GM-CSF 유전자를 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-△B7에 삽입하여 △B7/IL12, △B7/GM, 그리고 △B7/IL12/GM 바이러스를 제작하였다. 제작한 아데노바이러스에 의해 IL-12와 GM-CSF의 발현 정도를 ELISA를 시행하였으며 바이러스 용량 비례적으로 IL-12와 GM-CSF가 발현되었음을 알 수 있었다. C57BL/6 마우스에 형성된 B16F10 흑색종에 △B7/IL12/GM 바이러스를 투여한 경우, 종양 주변과 마우스 비장에서 CD4+와 CD8+ T 세포 군집이 다른 실험군에 비해 증가하였으며 GM-CSF의 발현에 의해 종양 주변으로의 antigen presenting cell(APC) 세포 군집이 증가함을 관찰하였다. 또한, CTL assay와 IFN-γ ELISpot assay를 시행한 결과, △B7/IL12/GM 바이러스를 투여한 마우스의 경우 암세포 특이적 면역반응에 의해 세포 살상능이 증가하였을 뿐만 아니라 항종양 효과에 중요한 사이토카인으로 알려진 IFN-γ를 분비하는 세포군집도 증가함을 관찰하였다. 뿐만 아니라 암에 대한 면역 기억능이 증가되는지 알아보고자 마우스 한 개체 내에 두 개의 종양 모델과 면역 기억 세포의 표지자를 이용한 FACS 실험을 통해 △B7/IL12/GM 바이러스를 투여한 마우스에서 면역 기억능이 유도되었음을 확인하였다. 사이토카인을 분비하는 아데노바이러스에 의해 항종양 효과와 면역 기억능 증가 이외에도 마우스 면역기관의 변화를 관찰하였으며 특히 흉선의 크기는 종양의 크기와 매우 밀접한 관계가 있음을 관찰하였다. 즉 항종양 효과가 미비하여 종양의 크기가 활발하게 성장하는 음성 대조군 그룹에서는 종양의 크기가 커질수록 마우스 흉선의 크기가 줄어들었으며 항종양 효과가 뛰어난 경우 같은 주령의 흉선의 크기와 대동소이함을 관찰하였다. 마우스 흉선의 변화를 H & E 염색을 실시한 결과 흉선의 수축이 일어난 경우 흉선의 cortex 부분이 소실되었을 뿐만 아니라 cortex와 medulla의 경계가 사라졌으며 TUNEL assay 실시한 결과 흉선의 수축 주요 메커니즘이 세포고사임을 알 수 있었다. 이상과 같은 결과들에 따라, 본 연구에서 제작한 △B7/IL12/GM 종양 특이적 살상 아데노바이러스는 바이러스의 증식에 의한 암세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 감염된 세포에서 IL-12와 GM-CSF를 지속적으로 발현시켜 숙주의 항종양 면역능이 증가되어 효율적으로 암세포를 살상시키기 때문에 암 유전자 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다. [영문]IL-12 exhibits important biological activities, including the ability to enhance NK and CTL activities and to direct a cell-mediated immune response by generating a Th1-type immune response and inhibiting differentiation of Th2-type lymphocytes. Recent reports demonstrated that IL-12 administration could enhance the stimulatory capacity of bone marrow-derived DCs in vitro. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) is the most potent stimulator of a specific and long-lasting antitumor immunity and documented its importance for the maturation of antigen presenting cells into stimulators of T cell activation. On the basis of these findings, we decided to evaluate the capacity to enhance anti tumor- effect. To increase the potential anti-tumor activity of oncolytic adenovirus, we constructed △B7/IL12/GM oncolytic adenoviral vector deleted E1B region(E1B55 kDa and E1B19 kDa) and mutated retinoblastoma(Rb) binding sites. The expression of IL-12 and GM-CSF was confirmed by ELISA. The therapeutic efficacy of oncolytic adenovirus expressing IL-12 and GM-CSF was evaluated in an immunocompetent mouse bearing murine melanoma B16F10 tumor. The results showed significant inhibition of tumor growth treated with saline-treated tumors. Moreover, the IL-12 and GM-CSF expressing oncolytic adenovirus demonstrated enhanced anti-tumor activity and a higher incidence of complete tumor regression compared to tumors treated with the analogous vector(△B7) that lacks the IL-12 and GM-CSF transgene. Survival was also significantly prolonged in △B7/IL12/GM treated animals. To establish that the abserved anti-tumor effect is associated with the generation of tumor-specific immune response, we carried out CTL assay. Number of cells expressing IFN-γ, a cytokine secreted by CTL was evaluated through IFN-γ ELISpot assay. We observed that △B7/IL12/GM induced higher specific killing effect than those treated with △B7. Moreover CD4+ and CD8+ T cell population was elevated in △B7/IL12/GM treated mice compared to △B7 treated mice. We investigated the relationship between tumor growth and the important alteration in the size of thymus. TUNEL assay was performed to examine apoptosis in situ, in whole thymus tissue section. With this methodology, significant differences in the level of apoptosis were demonstrable between the thymi from PBS or △B7-treated mice and those from cytokine expressing adenovirus treated tumor bearers. In conclusion, the finding of this study demonstrate the effectiveness of augmenting the immune response against tumors with oncolytic adenovirus expressing both IL-12 and GM-CSF. The △B7/IL12/GM showed augmented and prolonged effect in suppressing tumor growth in vivo. Given the results shown in this study, IL-12 and GM-CSF gene transfer provides a potential therapeutic strategy for the management of neoplasia.ope