Molecular and phenotypical characteristics of 16S rRNA methylase producing gram-negative bacilli

의학과/박사[한글] Aminoglycoside 항균제는 세균의 ribosome과 불가역적으로 결합하여 단백합성을 저해하는 살균성 항균제로, 단독 또는 병합 요법으로 흔히 사용된다. 근래에 aminoglycoside제의 작용 표적인 30S ribosome을 구성하는 16S rRNA를 methylation하여 임상적으로 유용한 모든 4, 6-substituted deoxystreptamine 항균제에 고도 내성을 보이게 하는 새로운 내성 기전이 보고되었으나, 이에 대한 국내의 연구는 드물다. 이에 본 연구에서는 서울과 경기도에 소재하는 2차와 3차 병원의 환자에서 분리되는 그람음성 간균 중에서 16S rRNA methylase를 생성하는 균주의 빈도와 그 내성 유전형, 또한 이들 세균 중에 β-lactam제와 fluoroquinolone제 등에 대한 다제 내성 양상을 규명하고자 하였다.2006년 7월부터 2007년 6월까지 경기도 화정에 위치한 2차 병원과 2007년 4월부터 6월까지 서울에 위치한 3차 병원에 내원한 환자에서 분리한 일련의 균주, 즉 Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter 균종 및 Stenotrophomonas maltophilia를 대상으로 하였으며, 중복 분리주는 제외하였다.균종 동정은 전통적인 생화학적 방법과 상품화된 kit를 이용하였다. 수집한 균주는 디스크 확산법과 한천 희석법으로 β-lactam제, aminoglycoside제 및 fluoroquinolone제에 대한 항균제 감수성을 시험하였다. Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 생성은 double disk synergy 법으로 시험하였고, plasmid-mediated AmpC β-lactamase (PABL)생성은 cefoxitin 감수성 시험 결과로 추정하였다. Carbapenemase의 생성은 modified-Hodge 법과, imipenem-EDTA double disk synergy 법으로 시험하였다.16S rRNA methylase 생성은 arbekacin 디스크를 이용하여 선별한 후, PCR로 유전자(armA, rmtA, rmtB, rmtC 및 rmtD)를 검출하였고 유전자 염기 서열을 분석하여 빈도와 유전형을 결정하였다. Plasmid-mediated quinolone 내성 기전은 qnrA, qnrB, qnrS 및 qepA 유전자에 대한 PCR과 염기 서열 분석으로 시험하였다. 16S rRNA methylase와 qnr 유전자 양성인 균주의 유전적 연관성을 규명하기 위해 pulsed-field gel electrophoresis를 시행하였다.16S rRNA methylase는 2007년 4월부터 6월에 세브란스병원에서 분리된 임상 균주 중, E. coli 2주 (128 μg/mL으로 높았고 감수성인 균주는 없었다. 16S rRNA methylase 생성 K. pneumoniae의 ESBL 및 PABL 양성율은 59% 및 92%로 음성 균주의 43% 및 64%에 비해서 높았으며, 특히 16S rRNA methylase를 생성하는 K. pneumoniae의 91%가 qnrB를 동시에 가지고 있었다. Plasmid-mediated quinolone efflux pump를 생성하는 qepA 유전자는 rmtB 유전자 양성인 E. coli 및 C. freundii와 16S rRNA methylase 음성인 1주의 E. coli에서 양성이었다. 16S rRNA methylase 양성인 Pseudomonas 및 Acinetobacter 균종에서 metallo-β-lactamase를 생성하는 균주는 없었다. 16S rRNA methylase를 생성하는 균주의 유전적 연관성을 알아보기 위해 시행한 PFGE에서는 다양한 양상을 보였다.이상으로, 국내에서 16S rRNA methylase 유전자에 의한 aminoglycoside 고도 내성인 그람음성 간균은 외국에 비하여 흔하였고, 여러 균종에 널리 퍼져 있으며, 유전적 구조도 다양한 것으로 판단된다. 또한 이들 균주들은 ESBL, PABL 및 qnrB 같은 내성 유전자를 동시에 갖는 경우가 흔하였다. [영문]Aminoglycoside antibiotics, widely used in clinical settings as monotherapy and combination therapy, bind to 16S rRNA of bacterial ribosome irreversibly and interfere with the protein synthesis. Recently a novel plasmid-mediated resistant mechanism that conferred methylation of 16S rRNA and high-level resistance to 4,6-substituted deoxystreptamine antibiotics was reported. But the report to this novel resistant mechanisms were rare in Korea. The aims of this study were to determine the prevalence of the 16S rRNA methylase genes in clinical isolates of gram-negative rods such as Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species and to characterize the coresistance to other antibiotics such as β-lactams and fluoroquinolones.Consecutive non-duplicate gram-negative bacilli were isolated from clinical specimens at a Korean secondary hospital from July 2006 to June 2007 and a tertiary-care hospital from April to June 2007. The species were identified by conventional methods or by using the Vitek systems. The antimicrobial susceptibility was tested by the CLSI disk diffusion and agar dilution method using ceftazidime, cefoxitin, imipenem, arbekacin, amikaicin, gentamicin, tobramycin and levofloxacin. Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) production was confirmed by double disk synergy test and the production of plasmid-mediated AmpC β-lactamase (PABL) was analyzed by cefoxitin susceptibility. Imipenem-nonsuceptible isolates were tested for carbapenemase production by the modified-Hodge and imipenem-EDTA double disk synergy test. Polymerase chain reaction was performed to detect the 16S rRNA methylase genes (armA, rmtA, rmtB, rmtC, and rmtD) in the arbekacin-resistant isolates and plasmid-mediated quinolone resistant genes (qnrA, qnrB, qnrS, and qepA) were detected in 16S rRNA methylase-positive isolates. To analyze the genetic relationships, pulsed-field gel electrophoresis was performed in 16S rRNA methylase and plasmid-mediated quinolone resistance gene-positive isolates.16S rRNA methylase genes were detected in 2 (<1%) isolates of E. coli , 24 (11%) K. pneumoniae, 1 (2%) K. oxytoca, 4 (10%) Citrobacter spp., 2 (4%) Enterobacter spp., 2 (4%) S. marcescens, 1 (20%) Achromobacter xylosoxidans, 11 (10%) Acinetobacter spp., and 1 S. maltophilia at tertiary-care hospital, 8 (1%) E. coli, 51 (21%) K. pneumoniae, 3 (8%) Citrobacter spp., 2 (2%) Enterobacter spp., 4 (8%) S. marcescens, 2 (4%) P. miriabilis, 1 (