Induction of apoptosis by 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) in cancer cells

치의학과/석사[한글]암은 지속적인 세포 분열에 의해 조절되지 않는 세포 증식이 일어나는 질병이다. 지난 수 십 년 동안 암 치료를 위한 항암제의 역할이 증대되었지만 아직도 만족할만한 효과를 얻지 못하고 있는 실정이다. 따라서 심각한 독성을 나타내지 않고 암세포에 선택적으로 작용하여 암을 치유하는 항암제의 개발이 필요한 상태이다.1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ)은 GTP를 cGMP로 전환시키는 효소인 soluble guanylyl cyclase (sGC)의 특이적 억제제로 알려져 있다. 그런데 ODQ가 자궁 상피세포에서 DNA 분절을 유발한다는 보고가 있어 sGC가 세포 생존에 관여하고 이의 억제가 세포의 사멸을 유발할 가능성이 제시되었다. 따라서 본 연구에서는 ODQ가 어떤 기전으로 세포사를 유발하는지 HeLa 세포를 이용하여 확인하였다.HeLa 세포에서 ODQ는 20 - 100 μM 농도범위에서 농도에 비례하여 세포 생존율을 감소시켰으며 50 μM과 100 μM 농도에서 시간에 비례하여 세포사를 유발하였다. ODQ에 의한 세포사는 PC12 세포 보다는 HeLa 세포와 같이 빠르게 분열하는 세포에서 더욱 효과가 뚜렷하였다. ODQ는 HeLa 세포의 DNA 분절을 유발하였으며 Annexin V와 Propidium Iodide로 염색한 세포를 FACS로 분석한 결과 초기 및 후기 apoptosis를 유발함을 확인하였다. 세포사에 대한 ODQ의 효과가 sGC 봉쇄작용과 관련이 있는지 확인하기 위하여 세포막을 통과하여 세포내로 들어가는 8-bromo-cGMP를 처리하고 ODQ를 투여한 결과 HeLa 세포의 세포사를 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 ODQ에 의해 유도되는 세포사가 sGC 봉쇄작용과는 무관함을 나타낸다. 그러나 산화형의 hemoprotein을 환원시키는 약물인 dithionite가 ODQ의 세포사 유발효과를 억제하였는데 이는 ODQ의 세포사 유발효과가 세포내 heme 함유 단백의 산화와 관련이 있음을 암시한다.결론적으로 본 연구를 통해 ODQ가 sGC와 무관하게 HeLa 세포의 세포사를 유발함을 확인하였다. [영문]Cancer is a disease of cell proliferation, which results in the dysregulated growth of cells. Although the role of anticancer drugs in cancer treatment has expanded in the past few decades, chemotherapy is still not satisfactory. The development of cancer cell-specific cytotoxic drugs is required to achieve a "cure" with no significant toxicity, which is the goal of anticancer drug therapy.1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) has been known as a specific inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC) that catalyses the conversion of GTP into cGMP. Previously, sGC inhibition by ODQ was reported to trigger apoptotic DNA fragmentation in immortalized uterine epithelial cells. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanism by which ODQ inhibited proliferation and induced cell death in HeLa cells.Treatment of HeLa cells with ODQ induced concentration-dependent decrease in cell viability over the range 20 - 100 μM. ODQ also exerted time-dependent cell death at concentration of 50 and 100 μM with 48 h. ODQ-induced cell death was more prominent especially in the rapidly proliferating tumor cell lines, such as HeLa cells. Treatment of HeLa cells with 50 μM ODQ triggered DNA fragmentation. In addition, FACS analysis using Annexin V and PI staining revealed that ODQ induced early and late apoptosis in a time-dependent manner. To examine whether the inhibition of sGC was responsible for the ODQ’s effect on proliferation and viability of the cells, we used 8-bromo-cGMP, a cell permeable cGMP analogue. Addition of 8-bromo-cGMP in the presence of ODQ failed to rescue HeLa cells from cell death. These results suggested that ODQ’s effect on triggering cell death was independent of the inhibition of sGC. However, dithionite, a powerful reducing agent that reduces the oxidized form of hemoproteins, was shown to prevent these ODQ’s effects, suggesting that ODQ’s effect on proliferation and viability of the cells might be exerted by the oxidation of unidentified heme-containing protein.In conclusion, these results indicate that ODQ induces sGC-independent decrease in cell viability in HeLa cells. Oxidation of an uncharacterized intracellular heme-containing protein might be responsible for the ODQ-induced cell death.ope