Mechanism of Na+-Ca2+ exchange-induced regulation of L-type Ca2+ current in the ventricular myocyte

의학과/박사[한글]심장에서 L-type Ca2+ 통로는 막전압의 탈분극에 의해 활성되어 세포안과 밖의 Ca2+ 농도차에 의해 세포 외부로부터 세포 내부로 Ca2+을 들어오게 하는 주요한 Ca2+ 유입통로이고 Na+-Ca2+ 교환(Na+-Ca2+ exchanger; NCX)은 한 분자의 Ca2+을 세분자의 Na+과 맞교환하며 세포내 Ca2+을 세포 밖으로 배출하는 주요한 Ca2+ 배출기전이며 이완 유발 기전이다. 최근에 NCX를 over expression 시킨 동물 모델과 cardiac specific knock out 시킨 동물 모델에서 NCX가 L-type Ca2+ 통로의 Ca2+ 의존적 불활성(Ca2+-dependent inactivation; CDI)을 조절할 가능성이 제시되었다. 그러므로 본 연구에서는 심장에서 L-type Ca2+ 통로와 NCX의 상호작용을 규명하기 위해 L-type Ca2+ 통로와 NCX가 같은 Ca2+ micro-domain에 존재하고 있는지를 확인하고 아울러 L-type Ca2+ 통로와 NCX의 활성이 상이한 흰쥐, 토끼, 기닉픽에서 Ca2+ micro-domain에 존재하는 NCX의 비율을 추구함으로서 종간 차이를 비교하고자 하였다. 이러한 목적을 달성하기 위해 효소로 분리한 심실근세포에서 whole-cell patch clamp를 시행하였고, NCX의 영향은 BAPTA가 존재할 때와 존재하지 않을 때에 탈분극 자극으로 발생한 L-type Ca2+ 전류에서 Na+을 배제한 약물용액(0Na)으로 NCX를 봉쇄한 후 억제되는 전류로 관찰하였다. 이와 같은 실험으로 얻은 결과는 다음과 같다.1. 흰쥐 심실근세포에서 0Na은 L-type Ca2+ 전류의 전하 유입량을 45.3±4.3% 억제하였고, 0Na으로 억제되는 실제 전류는 10 ms 근처에서 피크를 이루었다.2. Ryanodine 처치로 근소포체의 Ca2+ 유리를 봉쇄할 경우 L-type Ca2+ 전류의 전하 유입량은 62.0±22.4% 증가하나, 0Na은 여전히 전하 유입량을 48.8±7.7% 억제하였다. 이때 0Na으로 억제되는 실제 전류는 10 ms 근처에서 이루어지는 첫 번째 피크에 이어 새로이 20 ms 근처에서 두 번째 피크를 발생하였다.3. 10 mM BAPTA 처치는 흰쥐 심실근세포내 Ca2+ transient를 완전히 사라지게 하였으나, 0Na으로 봉쇄되는 전류를 완전히 봉쇄하지는 못하였다. 특히 0Na으로 봉쇄되는 실제 전류에서 나타나는 첫 번째 피크는 억제하지 않는 반면, ryanodine 처치로 발생되는 두 번째 피크는 완전히 봉쇄하였다.4. Ryanodine 전처치로 새로이 발생되는 두 번째 피크는 isoproterenol 처치로 더 크게 증가하였지만, BayK 8644 처치 시에는 그 크기가 오히려 억제되며 오른쪽으로 이동되었다. 반면, 두 약물은 10 mM BAPTA 처치시 잔류하는 전류를 증가시켰으며, 결과적으로 0Na으로 봉쇄되는 전체 전류에서 BAPTA로 억제되지 않는 전류의 비율은 BayK 8644 처치 후 38.6%에서 64.2%로 증가하였다.5. 토끼와 기닉픽의 경우 0Na으로 봉쇄되는 실제 전류는 흰쥐에서와는 달리 대조군에서 이미 2개의 피크를 이루었다. Ryanodine 처치는 두 번째 피크를 증가시켰고, isoproterenol 및 BayK 8644 처치는 흰쥐와 유사한 반응을 나타내었으나, BayK 8644 처치 후 최대가 되는 BAPTA로 억제되지 않는 전류의 비율이 토끼와 기닉픽에서 각각 31.4%와 19.9%로 흰쥐에서보다 감소하였다.이상의 결과로부터, NCX는 L-type Ca2+통로와 같은 기능적 Ca2+ micro-domian내에 적어도 흰쥐, 토끼, 기닉픽에서 각각 64%, 31%, 20%가 존재함으로써 L-type Ca2+ 통로의 CDI 유발 작용이 근소포체로부터 유리되는 Ca2+보다 더 우수한 작용을 발현하는 L-type Ca2+ 통로를 통해 유입되는 Ca2+을 배출하면서 L-type Ca2+ 통로의 CDI를 조절하고 있다는 결론을 얻었다. [영문]In the heart, L-type Ca2+ channel (LTCC) is a major path, through which Ca2+ enters cell according to its concentration difference across the sarcolemma during activation. While Na+-Ca2+ exchange (NCX) contributes as a major path, through which Ca2+ is extruded from cell causing relaxation by exchanging 3Na+ against 1 Ca2+. Recently, it has been suggested in the animal model overexpressing or knocking out cardiac-specific NCX that NCX might regulate Ca2+-dependent inactivation (CDI) of LTCC. Therefore, this study is planned to clarify the interaction between LTCC and NCX, and its mechanism taking place especially in the same functional Ca2+ microdomain as the LTCC as well as its species differences. To achieve these goals, we directly measured and compared influence of NCX blocking after Na+-depletion (0Na) in the presence and absence of 10 mM BAPTA, a fast Ca2+ buffer, in the isolated single ventricular myocytes from the rat, rabbit and guinea-pig. The result were as followed;1. In the rat ventricular myocytes, 0Na suppressed charge influx of ICaL by 45.3±4.3% showing a single peak around 10 ms in time related change of the actual inward current suppressed by 0Na.2. 0Na still suppressed the ICaL charge influx by 48.8±7.7% even after SR Ca2+ release blocking with ryanodine, which increased the ICaL charge influx by 62.0±22.4%. Interestingly, in this case, the second peak was newly developed around 20 ms immediately following the initial peak developed around 10 ms in its actual inward current suppressed by 0Na.3. Internal dialysis of myocytes with 10 mM BAPTA, which completely abolished the intracellular Ca2+ transient, still preserved the 0Na-induced ICaL suppression in spite of its reduced magnitude showing a complete suppression of the second peak but no suppression in the initial peak in the actual inward current suppressed by 0Na.4. The second peak developed after ryanodine pretreatment was increased after isoproterenol, but rather slightly suppressed and shifted rightward after BayK 8644 increasing the BAPTA-resistant proportion of the total inward current suppressed by 0Na from 38.6% to 64.2%.5. Contrastingly, in the cases of rabbit and guinea-pig, the actual inward current suppressed by 0Na showed two peak even in the absence of ryanodine pretreatment, which increased the second peak. The second peak was also increased after isoproterenol and slightly suppressed and shifted rightward after BayK 8644 as like in the rat. the BAPTA-resistant proportions of the total inward current suppressed by 0Na obtained after BayK 8644 were 31.4%, and 19.9% in rabbit, and guinea-pig, respectively.From these results, it is concluded that NCX regulates CDI of the LTCC by extruding Ca2+ from cell immediately after its entry through the LTCC, but before it triggers CDI in the heart, because at least 64%, 31%, and 20% of NCX activity is concentrated in the same functional Ca2+ microdomain as the LTCC in the heart of rat, rabbit and guinea-pig, respectively.ope