Effects of brimonidine on expression of fibronectin and intracellular signaling pathway

의학과/박사[한글] 수술 후 창상치유과정에서 반흔조직을 형성하는데 중심 역할을 하는 성장인자인 TGF-β를 결막하섬유아세포에 처리하여 녹내장수술 후의 창상치유과정과 유사하게 만든 후 항녹내장약제로 알려진 선택적 α2 작동제인 brimonidine을 처리하여서 녹내장여과수술 후 반흔형성에 중요한 역할을 하는 세포외기질인 fibronectin의 생성에 어떠한 영향을 주는지를 보고 이러한 현상이 생기는 신호전달에 대해 알아보고자 하였다.TGF-β1을 처리하여서 활성화된 결막하섬유아세포에서 fibronectin의 expression, TGF-β1과 brimonidine을 농도별로 처리한 결막하섬유아세포에서 α2 수용체의 expression, TGF-β1과 brimonidine을 농도별로 처리한 결막하섬유아세포에서 fibronectin의 expression, brimonidine이 phospho SMAD의 전달체계에 미치는 영향, brimonidine이 결막하섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 실험하였다.대조군에 비해서 TGF-β1이 처리된 결막하섬유아세포에서 fibronectin의 발현양이 증가하였다. TGF-β1만 처리한 결막하섬유아세포에서 α2 수용체의 발현이 많아졌으며 TGF-β1과 brimonidine을 처리한 경우 α2 수용체의 발현이 감소하는 것을 관찰하였다. TGF-β1만 처리한 결막하섬유아세포에서는 fibronectin의 발현이 증가하였지만 TGF-β1과 brimonidine을 처리한 경우에는 fibronectin의 발현양이 줄어들었다. TGF-β1만 처리했을 때에는 phospho SMAD의 발현이 증가하였으나 TGF-β1과 brimonidine을 동시에 처리한 결막하섬유아세포에서는 phospho SMAD의 발현양이 현저하게 줄어드는 것을 관찰하였다. MTT assay 결과를 보면 TGF-β1만 처리한 군에서는 결막하섬유아세포가 15% 증가해 있었으며 TGF-β1과 brimonidine을 처리한 군에서는 결막하섬유아세포의 수가 20%정도 줄어들었다.이상의 결과로 TGF-β를 첨가한 결막하섬유아세포에 brimonidine을 처리한 경우 결막하섬유아세포의 증식과 fibronectin의 생성이 억제되고 TGF-β에 의한 세포내 신호전달 또한 억제되었다. 향후 brimonidine이 TGF-β에 의한 세포내 신호전달을 억제하는 자세한 기전이 연구가 되면 brimonidine을 녹내장여과수술 후에 결막의 반흔조직 형성을 억제하는 약물로 사용해 볼 수 있으며 또한 녹내장여과수술 후에 안압이 충분히 떨어지지 않아서 항녹내장약제를 추가할 때에 다른 것보다 먼저 선택해 볼 수 있는 약제로 생각해 볼 수 있다. [영문]Transforming growth factor-β (TGF-β) have been shown to play a key role in wound healing after trabeculectomy and they use SMAD pathway for signaling. In this study we examine the effect of brimonidine, relative alpha 2 agonist, on expression of fibronectin and phospho SMAD in subconjuctival fibroblasts (SCFs) activated by TGF-β. We stimulated the human cultured SCFs for 48hrs with various concentrations of TGF-β1 and immunoblotted with anti-fibronectin antibody. SCFs treated with or without TGF-β1 were cultured in the presence of various concentrations of brimonidine (10nM, 100nM, 1uM, 10uM) and examined by western blot analysis. In order to know the effect of brimonidine on SMAD signaling pathway, SCFs stimulated with TGF-β1 were cultured in the presence of brimonidine 100nM and with anti-phospho SMAD antibody. Cell viability was detected by MTT assay. SCFs expressed alpha 2 receptors. SCFs activated by TGF-β1 enhanced the expression of fibronectin. Brimonidine reduced the expression of fibronectin in SCFs activated by TGF-β1. Brimonidine reduced the expression of phospho SMAD in early period. TGF-β1 stimulated the proliferation of SCFs and brimonidine inhibited the proliferation of SCFs. These results may indicate that brimonidine inhibits the expression of fibronectin via reduction of phosphorylation of SMAD. Further study will be needed to find out the mechanism that brimonidine inhibits the phosphorylation of SMAD.ope