Identification and clinical signification of SPARC inactivation through promoter hypermethylation in human

의과학과/석사[한글] CpG island 메틸화는 유전자 프로모터 부위의 CpG islands에 메틸기가 결합하여 mRNA 전사가 방해를 받아 유전자 발현이 억제되는 현상으로 종양억제유전자의 발현을 억제시킴으로써 암 발생에 큰 영향을 미친다.본 연구에서는 oligonucleotide microarray 기술을 이용하여 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써 대장암에서 CpG island 메틸화에 의해 발현 감소되는 유전자를 발굴하고자 하였다. 이를 위해 대장암 세포주에 메틸화 억제제인 5-aza-2''-deoxycytidine을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹, 정상 대장 점막 조직 그룹, 이렇게 세 그룹을 oligonucleotide microarray 실험을 시행하여 유전자 발현 패턴을 비교, 분석하였다. 그리하여 5-aza-2''-deoxycytidine에 의해 재발현되고, 정상 대장조직에서 유의미하게 발현 증가하는 유전자 226개를 발굴하였다. 이 중 기존에 대장암에서 메틸화되어있다고 알려진 유전자, CpG island가 존재하지 않는 유전자, 기능이 알려지지 않은 유전자를 제외시키고 암과 관련이 있는 기능을 가진 유전자 70개를 선별하였다. 이들 유전자 중 SPARC (secreted protein acidic rich in cysteine)는 실험에 사용한 7개의 모든 세포주에서 정상 대장조직에 비하여 발현 감소되었고, 5-aza-2''-deoxycytidine 처리 전, 후 세포주의 SPARC 발현 양상을 비교해 보았을 때 7개 세포주 중 4개 세포주가 발현 증가하는 양상을 보였다. 또한 SPARC 유전자는 기존의 연구 자료에서 조직의 분화나 종양의 발생에 다양하게 관여하는 것으로 있기 때문에 대장암과 SPARC 유전자 프로모터 메틸화의 상호관계를 구체적으로 조사하였다. 대장암 세포주에서 RT-PCR로 SPARC mRNA가 발현되지 않음을 확인하였고, 이것이 유전자 소실에 기인하는 것이 아님을 PCR-LOH로 확인하였다. 대장암 세포주에서 메틸화 억제제에 의한 SPARC의 재발현이 7개 세포주 중 5개의 세포주에서 확인되었고, methylation specific PCR (MSP)로 프로모터 메틸화를 분석한 결과, 7개 세포주에서 6개 세포주가 메틸화되어있음을 확인하였다. 인체 대장 조직에서 SPARC 프로모터의 메틸화는 20예의 대장암 조직에서 20예 모두가 메틸화되어있는 반면, 이에 상응하는 20예의 정상 대장 조직에서는 3예가 메틸화되어있음을 MSP로 확인하였다. 또한 대장암에서 SPARC의 발현 감소가 임상적으로 어떤 의의가있는가를 알아보기 위해 292예의 대장암 조직이 포함된 조직 array를 사용하여 SPARC 표현 여부와 예후와의 관계를 분석한 결과 SPARC를 발현하지 않는 예들은 SPARC를 발현하는 집단에 비해 불량한 예후를 보임을 알 수 있었다 (P=0.0001).따라서 대장암에서 SPARC 유전자는 프로모터 과메틸화로 인한 유전자의 불활성을 보이며, 이러한 SPARC 유전자의 발현 억제는 대장암 발생에 관여할 것으로 추정된다. [영문]Epigenetic alteration is an important mechanism in the development of human cancer. In particular, inactivation of tumor suppressor genes through the hypermethylation of CpG islands located in their promoter regions is firmly established as an important mechanism for gene inactivation in cancer.In this study, we intended to discover the gene showing CpG island hypermethylation in human colorectal cancer. We analyzed the altered expression pattern before and after 5-aza-2''- deoxycytidine treatment by using oligonucleotide microarray technology.We found that the RNA expression of 226 out of 18,664 genes were induced after 5-aza-2''-deoxycytidine treatment. Among these 226 genes we selected 70 novel genes that were not previously reported to be hypermethylated in colorectal cancer.Among these genes, SPARC (secreted protein acidic rich in cysteine) was markedly reduced in comparison to normal colonic mucosae in all seven cell lines, and is known to be involved in carcinogenesis to various extents.In colorectal cancer cell lines, we confirmed that SPARC mRNA was not detected by RT-PCR, and PCR-LOH analysis showed that this was not due to gene destruction. MSP demonstrated hypermethylation of six out of the seven cell lines. Also, re-expression of SPARC was demonstrated in five out of the seven cell lines after treatment of the cell lines with the demethylating agent 5-aza-2''-deoxycytidine. In human tissues, the methylation of SPARC promoter was found in all twenty human colorectal carcinomas but only three among the corresponding twenty normal colonic musosae were methylated.An immunohistochemical and survival analysis of 292 colorectal carcinoma cases demonstrated a poorer prognosis in the group without SPARC expression than the group with normal SPARC expression (P=0.0001).In conclusion, epigenetic gene silencing of SPARC is frequent in colon cancers, and the inactivation of SPARC may be involved in colonic tumorigenesis.ope