Evaluation of periodontal ligament cell viability in rat teeth according to various extra-oral dry time using MTT assay

치의학과/박사[한글] 본 연구의 목적은 MTT 검색법을 이용하여 흰쥐 상악 대구치를 발거한 후 실온의 건조 상태에서의 시간 변화에 따른 쥐 치아 치근면의 치주인대 세포 활성도를 측정함과 동시에 냉동 절단법을 이용한 조직학적인 관찰 결과를 토대로 하여 MTT검색법이 유용한지를 검증하고자 하였다. 생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 80마리를 이용하여 β-APN 전처치 후 상악 제 1 & 2 대구치를 모두 발거하였다. 이들 치아를 즉시 혹은 10, 20, 40, 60분 동안 실온에서 건조 시킨 후 치아 자체를 MTT용액에 저장한 다음 흡광도 측정을 이용한 정량적 분석과 동시에 냉동 절단법을 이용하여 조직을 관찰하였다. MTT 검색에 의한 흡광도 값에 있어 즉시 처치군과 10분 건조군 사이에는 통계학적인 유의차가 없었다(p>0.05). 그러나, 즉시 처치군 및 10분 건조군은 20분과 40분 및 60분 건조군과 비교시 통계학적인 유의차를 보였다(p<0.05). 또한, 20분 건조군도 40분 및 60분 건조군 과의 군 간 비교에서 각각 통계학적인 유의차를 보였다(p<0.05). 그러나, 40분 건조군과 60분 건조군 사이에는 통계학적인 유의차를 보이지 않았다. 조직학적 관찰에서 시간 경과에 따라 crystal의 모양과 분포 및 수에서 확연히 구별되는 특징적인 양상을 보여주었다. 즉시 및 10분 건조 군에서는 가시모양의 crystal이 전 치주인대부위 조직과 치수 내에 밀도 높게 골고루 폭넓게 퍼져 있었으나 20분 이상 건조 군에서부터는 치주인대와 치수 부위 조직 모두에서 crystal 결정체 수가 급격히 감소하는 양상을 보였다. 또한 crystal 결정체 모양도 시간이 경과될수록 극히 한정된 몇 군데 부위에 cluster처럼 뭉쳐져 있는 양상을 보였다. 이번 실험의 결과를 종합적으로 분석해보면 MTT 흡광도 측정값과 냉동 절단법을 이용한 시편의 MTT 염색 관찰 소견 결과를 서로 비교 했을때 상당히 밀접한 상관 관계가 있음을 보였다. 또한 임상에서 치아 이식이나 재식술의 높은 성공을 위해서는 치주인대의 활성도를 가능한 최대로 보존 해야 하며 그 한계시간은 구강 외 자연 건조시 20분 이내임을 이번 실험을 통해 알 수 있었다. 또한 이번 실험의 중요한 의미는 치주인대 세포의 활성도 평가에 있어서 MTT 검색법이 배양된 세포가 아닌 치근면에 붙어있는 세포를 직접 평가할 수 있는 새로운 대안의 평가법이 될 수 있는 가능성을 입증해 주었으며 앞으로 이 방법을 응용하여 발거된 치아를 장기간 보관하기 위한 저장액 개발에 관한 지속적인 연구와 개발에 도움을 주리라 생각된다. [영문]The purpose of this study was to verify the usefulness of MTT analysis as a tool of measurement of the periodontal ligament cell viability from the extracted rat molar directly on the exact time of time-lapse and simulately compared with histologic observation of frozen sections and by comparing MTT assay values with the direct histological examination of frozen sections of rat tooth root surface, the appropriateness of using MTT assay values in evaluating the PDL cell viability was verified. A total of 80 Sprague-Dawley white female rat of 4 week-old with a body weight of 100 grams were used. The maxillary left and right, first and second molars were atraumatically extracted under ketamine anesthesia. Twenty-four teeth of each group( divided as five groups depending upon the time-lapse after extraction such as immediate, 10, 20, 40 and 60 minutes)were immersed in 200㎕ of MTT solution(0.5mg ml) in each well of 96-well plate . Another 10 teeth of each group were treated as same as above and 10μm thick frozen sections from maxillary first and second molars were prepared, and then observed with optical microscope. The value of optical density obtained after MTT analysis was divided by the value of hematoxylin-eosin staining for the standardization. This divided value showed significant difference between groups with less than 10 minute time-lapse and subsequent groups (p<0.05). Histological findings of periodontal ligament cell, after being stained with MTT solution and being cryosectioned, also showed significant difference in crystal shape and crystal number between groups with less than 10 minute time-lapse and subsequent groups. Optical density after hematoxylin-eosin staining showed significant difference between first and second molar, but didn’t show meaningful difference between same molar in each group (p