Mechanisms involved in the inhibitory effects of mycophenolic acid on the PDGF-induced proliferation of vascular smo

의과학과/박사[한글] 혈관평활근 세포의 증식은 장기이식후 발생하는 혈관경화증이나 동맥경화증의 발생과 진행에 중요한 역할을 한다. Mycophenolic acid (MPA)는 강력한 면역억제제로서 혈관평활근 세포의 증식도 억제한다. 본 연구에서는 흰쥐와 사람 혈관평활근 세포를 이용하여 platelet-derived growth factor (PDGF)로 유도한 세포증식에 대한 MPA의 작용 기전을 연구하였다. 일차배양한 흰쥐와 사람 혈관평활근 세포를 PDGF-BB 10 ng/ml로 자극하였고, MPA를 비롯한 각 신호전달 억제제는 PDGF를 투여하기 1시간 전부터 투여하였다. 세포의 증식은 [H3]-thymidine incorporation, methyl- thiazoletetrazolium (MTT), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 표현, NAD(P)H oxidase subunit의 mRNA 표현은 RT-PCR, dichlorofluorescein (DCF)에 민감한 세포내 활성산소족은 FACS, 과산화수소(H2O2) 농도는 potassium iodide 법, 그리고 PDGF 수용체-β (Tyr 751), rac1, Akt, ERK 1/2 및 p38 MAPK 활성화는 Western blot 분석 방법을 사용하였다. PDGF 10 ng/ml 투여 후 흰쥐 혈관평활근 세포의 증식, PDGF 수용체와 Akt 활성화, 세포내 활성산소족, ERK 1/2와 p38 MAPK 활성화 및 NAD(P)H oxidase subunit 중 rac1의 활성화뿐만 아니라 p22phox와 MOX1의 mRNA 표현이 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다. MPA는 PDGF에 의한 세포 증식을 용량의존적으로 억제하였으며, 외부에서 투여한 guanosine 100μM은 MPA에 의한 증식억제 효과를 부분적으로 회복시켰다. 세포내 신호전달계에 대하여 MPA는 PDGF 수용체-β (Tyr 751) 활성화에는 영향을 주지 않았으나, Akt 활성화, rac1의 활성화, p22phox와 MOX1의 mRNA 표현의 상향 조절, 세포내 활성산소족 및 ERK 1/2와 p38 MAPK 활성화를 통계적으로 유의하게 억제하였다. 또한, MPA는 H2O2를 제거하였다. Wortmannin (PI3K 억제제), diphenyleniodonium (NAD(P)H 억제제) 및 NAC와 trolox (항산화제)는 PDGF에 의한 ERK 1/2와 p38 MAPK 활성화와 세포증식을 억제하였다. PD98059 (MEK 억제제)와 p38 I (p38 MAPK 억제제)는 PDGF에 의한 혈관평활근 세포의 증식을 현저하게 억제하였다. 사람의 혈관평활근 세포에서도 MPA는 PDGF에 의한 세포내 활성산소족 및 ERK 1/2와 p38 MAPK의 활성화를 억제하였다. 결론적으로, 본 연구결과는 MPA가 세포내 guanosine 생성 억제, Akt 활성화 억제 및 항산화 효과를 통한 MAPK 활성화 억제를 경유하여 PDGF에 의한 혈관평활근 세포의 증식을 억제함을 시사하였다. MPA의 항산화 효과는 H2O2에 대한 직접적 제거효과와 NAD(P)H oxidase 억제에 기인함을 시사하였다. [영문]Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation plays an important role in the development and progression of chronic allograft vasculopathy as in atherosclerosis. Mycophenolic acid (MPA), an immunosupressive agent, inhibits VSMC proliferation. In this study, the mechanisms involved in anti-proliferative effect of MPA was examined. Primary rat and human VSMCs were stimulated with platelet-derived growth factor (PDGF)-BB 10 ng/ml in the presence or absence of MPA (10 nM ～ 100 μM). The effect of known inhibitors of signaling molecules involved in VSMC proliferation were compared with that of MPA to confirm the involvement of each signaling molecule. Cell proliferation was assessed by [H3]-thymidine incorporation, methyl- thiazoletetrazolium (MTT), and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression, NAD(P)H oxidase subunits mRNA expression by reverse transcription-polymerase chain reaction, dichlorofluorescein (DCF)- sensitive cellular reactive oxygen species (ROS) by FACS, hydrogen peroxide (H2O2) concentration by iodometric analysis, and the activation of PDGF receptor-β (Tyr 751), rac1, Akt, ERK 1/2, and p38 MAPK by Western blot analysis. PDGF increased cell proliferation and cellualr ROS, activation of PDGF receptor, Akt, rac1, ERK 1/2, and p38 MAPK, and expression of p22phox and MOX1 mRNA, compared to control. MPA inhibited PDGF-induced VSMC proliferation in a dose-dependent manner. Exogenously administered guanosine partially rescued cell proliferation inhibited by MPA. MPA also inhibited PDGF-induced up-regulation of Akt and rac1 phosphorylation, p22phox and MOX1 mRNA expression, cellualr ROS, and ERK 1/2 and p38 MAPK phosphorylation. However, MPA did not affect PDGF receptor-β (Tyr 751) phosphorylation, suggesting that MPA''s anti-proliferative effect is independent on PDGF receptor activation. MPA directly scavenged H2O2. Wortmannin (PI3K inhibitor), diphenyleneiodonium (DPI, NAD(P)H oxidase inhibitor), N-acetylcysteine and trolox (anti-oxidants) all inhibited PDGF-induced ERK 1/2 and p38 MAPK activation and cell proliferation. PD98059 (MEK inhibitor) and p38 I (p38 MAPK inhibitor) inhibited PDGF-induced cell proliferation. In human VSMCs, MPA also suppressed PDGF-induced cellular ROS and activation of ERK 1/2 and p38 MAPK. In conclusion, these results suggest that MPA inhibits PDGF-induced VSMC proliferation through inhibiting de novo synthesis of guanosine, Akt activation, and cellular ROS leading to ERK 1/2 and p38 MAPK activation. Both direct scavenging and inhibiting NAD(P)H oxidase appear to be involved in anti-oxidative effect of MPA.ope