[[alternative]]Effects of the ninth position of residue, tryptophan, on the structure, dynamics and activity of an antimicrobial peptide, mastoparan-B

碩士[[abstract]]Mastoparan B（MP-B）是從黑腹胡蜂(Vespa basalis)毒液中分離出來，由14個胺基酸所組成的抗菌胜肽，其特色為含有多個正電性胺基酸殘基。在水中的構型為無序殘捲，但在TFE水溶液中能夠形成穩定的兩親性螺旋結構。在先前的文獻表明，MP-B上的第9號位置的芳香環殘基對於細胞膜相互作用與裂解是有影響的。在本研究，我們將9號位置的Tryptophan用非芳香環殘基Leucine置換(MP-BL9)，從之前研究發現9號位置芳香環殘基與13號位置Valine的γCH3有很強的疏水作用，因此將Valine用短鏈的Alanine取代(MP-BA13)，來探討芳香環側鏈和第13號位置的作用對結構及活性的影響。 CD實驗結果顯示，這些胜肽在30 % TFE溶液中形成α螺旋結構，螺旋長度沒有明顯不同，NMR結構模擬結果其螺旋範圍分別為，MPB : K4到V13、MPB-A13 : K4到A13和MPB-L9 : K4到V13。利用DOSY實驗分析分子的聚集行為，發現MP-B比MP-BA13、MP-BL9更容易形成寡聚體。再用弛緩實驗進行分子動態行為估算，螺旋片段的範圍動性較低，而MPB-L9在9號位置後的動性較高，推測是芳香環測鏈的影響，MPB-A13因其疏水表面積的影響，造成其Ala13動性較低。並利用大腸桿菌(E. coli)對MP-B、MP-BA13、MP-BL9做抗菌活性測試，發現MP-B抗菌活性優於其他其它類似物，這可能是MP-B其螺旋範圍具有較大的疏水表面積或是其芳香環與其它側鏈間作用的影響，造成它比其它類似物具有更好的疏水性和靜電作用力。[[abstract]]Mastoparan B (MP-B), a tetradecapeptide toxin isolated from the venom of the hornet(Vespa basalis), is an amphiphilic α-helical peptide with a primary structure of Leu-Lys-Leu-Lys-Ser-Ile-Val-Ser-Trp-Ala-Lys-Lys-Val-Leu-NH2. It forms a random coil in aqueous solution and adopts an ampliphlic α-helical conformation in trifluoroethanol (TFE). A previous study showed that the ninth position of aromatic residue, Tryptophan, is important for the helical conformation. Recognizing this fact, we attempt to answer the question how the structure and the biological activity of MP-B are affected by the aromatic residue in this study. In this work, we replaced Trp9 by Leu9, or Leu13 by Ala13 in the primary structure of MP-B. Results of CD indicated no significant change in the helical structures in 30% TFE solution. The NMR data of MP-B, MP-BA13, MP-BL9 indicated the induced helix involves residues from 4 to 13 in 30% TFE at 310K. The diffusion studies suggested that MP-B is more easier to form oligomers than MP-BA13, MP-BL9. in the model-free analysis of 13C relaxation data showed that the order parameter, S2, in the helix segment of these peptides are more restricted. The S2 of MP-BL9 is motional flexibile, which may be less interaction existed between aromatic residue and other residues. The experiments of antibacterial activity showed that MP-B has strongest activity among all the peptides. It is likely that the tryptophan residue, which has larger hydrophobic area and more NOEs, is more effective in both hydrophobic and electrostatic interactions than the other aromatic and Leucine residues. Both the interactions are essential in the binding affinities of MP-B with an anionic phospholipid layer of membranes.[[tableofcontents]]目錄 目錄 I 表目錄 IV 圖目錄 VII 縮寫表 XV 第一章 緒論 1 1.1 抗菌胜肽簡介 1 1.2 Mastoparan 家族 4 1.3 Mastoparan B 介紹 5 1.4 研究目的 6 第二章 材料與方法 9 2.1 實驗材料 9 2.1.1 藥品 9 2.1.2 實驗儀器 12 2.2 實驗方法 13 2.2.1 胜肽合成 14 2.2.2 胜肽純化與分子量鑑定 20 2.2.3 圓二色旋光光譜儀 23 2.2.4 抗菌活性測試 28 2.2.5 核磁共振實驗 32 2.2.6 二維核磁共振 (2D NMR) 36 2.2.7 DOSY 實驗 39 2.2.8 二次化學位移 44 2.2.9 結構計算 46 2.2.10 無模型法則 (model-free approach) 計算 50 第三章 實驗結果 57 3.1 圓二色旋光光譜 57 3.2 DOSY 實驗 60 3.3 二維核磁共振光譜 66 3.3.1 MP-BA13 濃度5 mM 在30% TFE-d3/ 70 % H2O，310 K 66 3.3.2 MP-BL9 濃度5 mM 在30% TFE-d3/ 70 % H2O，310 K 78 3.3.3 MP-B 濃度5 mM 在30% TFE-d3/ 70 % H2O，310 K 89 3.4 二次化學位移 94 3.5 結構計算 97 3.6 胜肽分子的動態行為 102 3.7 抗菌活性測試 106 第四章 討論 108 4.1 CD 光譜和NMR 結構 108 4.2 MP-B、MP-BA13、MP-BL9 及類似物聚集行為 111 4.3 MP-B、MP-BA13、MP-BL9 在30 % TFE 溶液中的動態行為 112 4.4 MP-B、MP-BA13、MP-BL9 的抗菌活性與結構之間的關係 119 第五章 結論 121 參考文獻 123 表目錄 表1-1: Mastoparan 家族。 4 表1-2: MP-B 及其胺基酸取代類似物活性比較。 7 表2-1: 合成時所使用活化、偶合和去保護的時間。 18 表2-2: HPLC 純化的梯度條件設定。 20 表2-3: 圓二色光譜儀實驗參數。 27 表2-4: 30% TFE-d3 / 70% H2O 樣品在310K 時所設定的參數。 42 表2-5: MP-BA13，MP-BL9 ,310 K 弛緩實驗的參數設定。 43 表2-6: 20 種常見胺基酸無序纏捲下的αH 化學位移。 44 表2-7: 20 種常見胺基酸無序纏捲下的αC、CO 和βC 化學位移。 45 表: 2-8: mfinput 變數。 55 表3-1: MP-B在0 % ~ 50 % TFE溶液，溫度300K下之α-helix 含量。 58 表3-2: MP-B、MP-BL9、MP-BA13 在溫度310K，30%TFE 溶液中的 α-helix 含量。 59 表3-3: MP-BA13 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度下的 擴散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。 63 表3-4: MP-BL9 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度下的擴 散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。 64 表3-5: MP-B 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度下的擴 散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。 65 表3-6: 濃度為5 mM的MP-BA13 在30 %TFE-d3/ 70 %H2O水溶液中， 溫度為310 K，pH 4 條件下的1H 的化學位移表。 76 表3-7: MP-BA13 310 K NOESY 光譜的NOE 訊號整理。 77 表3-8: 濃度為5 mM的MP-BL9在30 %TFE-d3/ 70 %H2O水溶液中， 溫度為310 K，pH 4 條件下的1H 的化學位移表。 87 表3-9: MP-BL9 310 K NOESY 光譜的NOE 訊號整理。 88 表3-10: 濃度3.7 mM的MP-B 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶液中， pH 4，溫度310 K 時的1H 化學位移表。 92 表3-11: MP-B 310 K NOESY 光譜的NOE 訊號整理。 93 表3-12: MP-BA13 和MP-BL9 在 310 K 的RMSD 值。 97 表3-13: MP-B，310 K 的R1、R2、NOE 弛緩實驗參數以及次序參 數( S2 )。 103 表3-14: MP-BA13，310 K 的R1、R2、NOE 弛緩實驗參數以及次序 參數( S2 )。 104 表3-15: MP-BL9，310 K 的R1、R2、NOE 弛緩實驗參數以及次序參 數( S2 )。 105 表3-16: MP-BA13 和MP-BL9 在310 K 的τm 值和S2 值。 105 表3-17: MP-BA13、MP-BL9 抑制生長率。 107 表3-18: MP-BA13、MP-BL9 半抑制濃度IC50。 107 表4-1: 經由XPLOR 一百個結構計算之結構統計。 108 表4-2: MP-B、MP-BA13、MP-BL9 在 310 K 之τm 值與平均次序參數 S2 值。 113 表4-3: 溶劑與殘基接觸面積 116 表4-4: MP-B Trp9 側鏈的4H、2,6H 與3,5H 與殘基間的NOE。118 圖目錄 圖1-1: 抗菌胜肽二級結構分類(a) α螺旋(b) β-sheet(c) extended(d) loop。 2 圖1-2: (A) 桶狀式 (barrel-stave mechanism)(B) 地毯式 (carpet mechanism)(C) 環狀穿孔式 (toroidal –pore mechanism)。圖中藍色 及灰色分別代表胜肽親水性及疏水性區域，方框中的圖示代表桶狀 式及超環狀孔式的上視圖。 3 圖1-3: MP-B 在TFE 下的20 個結構疊圖，Leu3 到Leu14 形成兩性 α-helix。 5 圖1-4: MP-B 及其胺基酸取代類似物20 個結構疊圖。 7 圖2-1: 固相胜肽合成流程圖。主要分為五大步驟: 酯化、去保護、 活化、偶合與斷切。 16 圖2-2: 斷切試劑選用圖。 19 圖2-3: 純化後MP-BA13 的HPLC 層析圖，主要波峰出現在13.80 分鐘。 21 圖2-4: 純化後MP-BL9 的HPLC 層析圖，主要波峰出現在13.46 分 鐘。 21 圖2-5: 經由MALDI -TOF Mass 測得MP-BA13 的分子量為1584.037。 22 圖2-6: 經由MALDI -TOF Mass測得的MP-BL9分子量為1539.077。 22 圖2-7: 光的電場和磁場的示意圖。 24 圖2-8: 光通過平面極化器後示意圖。 24 圖2-9: 平面偏極光軌跡示意圖。左圖為非旋光性物質；右圖為旋 光性物質。 24 圖2-10: 蛋白質二級結構CD 光譜圖。 26 圖2-11: 理想的劑量反應曲線。 30 圖2-12: 原子核在磁場B0下產生的磁矩μ 繞著磁場進動，頻率為ω。 32 圖2-13: 原子核在靜磁場中的能量分裂。 34 圖2-14: M0 在磁場B0 下受到外部磁場B1 偏轉到xy 平面。 35 圖2-15: 2D NMR 實驗脈衝序列上分為四個時期，分別為準備期、 演化期、混合期和偵測期。 36 圖2-16: 2D NMR 實驗中，將t1 時段做線性的增加。 37 圖2-17: 2D NMR 實驗的過程。 38 圖3-1: MP-B 在溫度300K，0%~50%TFE 溶液中的CD 光譜圖。 58 圖3-2: MP-B、MP-BL9、MP-BA13 在溫度310K，30%TFE 溶液中的 CD 光譜圖。 59 圖3-3: 濃度為5 mM 的MP-BA13 在303 K 下，30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，pH 4.的條件下之DOSY 光譜疊圖。 61 圖3-4: 濃度為5 mM 的MP-BL9 在303 K 下，30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，pH 4.的條件下之DOSY 光譜疊圖。 62 圖3-5: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之TOCSY 光譜。 67 圖3-6: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY光譜圖表示dαN(i,i+1)的NOE連結。 68 圖3-7: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY光譜圖表示dβN(i,i+1)的NOE連結。 69 圖3-8: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY光譜圖表示dNN(i,i+1)的NOE連結。 70 圖3-9: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dαN(i,i+2)、 dαN(i,i+3) 、dαN(i,i+4)的NOE 連結。 71 圖3-10: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)、 dβN(i,i+4)和Trp9 上的4HNOE 連結。 72 圖3-11: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dαβ(i,i+3)、 dαβ(i, i+4) (的NOE 連結。 73 圖3-12: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示Trp9 上2,6H 及3,5H 與其他胺基酸的NOE 訊號。 74 圖3-13: MP-BA13 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之[13C,1H]-HSQC 光譜。 75 圖3-14: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之TOCSY 光譜。 79 圖3-15: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dαN(i,i+1)的NOE 連 結。 80 圖3-16: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dβN(i,i+1)的NOE 連 結。 81 圖3-17: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dNN(i,i+1)的NOE 連結。 82 圖3-18: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dαN(i,i+2)、 dαN(i,i+3) 、dαN(i,i+4)的NOE 連結。 83 圖3-19: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dαβ(i,i+3)、 dαβ(i, i+4) (的NOE 連結。 84 圖3-20: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示尾端胺基與胺基酸的 NOE 訊號。 85 圖3-21: MP-BL9 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之[13C,1H]-HSQC 光譜。 86 圖3-22: MP-B 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之TOCSY 光譜。 89 圖3-23: MP-B 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)、 dβN(i,i+4)和Trp9 上的4H NOE 連結。 90 圖3-24: MP-B 在濃度為5 mM 30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度為 310K，pH 4.0 的條件下之NOESY 光譜圖表示Trp9 上2,6H 及3,5H 與其他胺基酸的NOE 訊號。 91 圖3-25: MP-B 在30% TFE-d3/70% H2O，310K 下的二次化學位移 (secondary chemical shift)。縱軸為MPB 的殘基與無序纏繞的αH 之 化學位移差值。 94 圖3-26: MP-BA13 在30% TFE-d3/70% H2O，310K 下的二次化學位 移(secondary chemical shift)。縱軸為MPB-A13 的殘基與無序纏繞 的αH 之化學位移差值。 95 圖3-27: MP-BL9 在30% TFE-d3/70% H2O，310K 下的二次化學位移 (secondary chemical shift)。縱軸為MPB-L9 的殘基與無序纏繞的α H 之化學位移差值。 96 圖3-28: MP-BA13 在310K 時，能量最小的20 個結構疊圖，顯示形 成α-helix 結構的位置為K4 到A13(左邊為N端，右邊為C 端)。 (A) 為殘基4-13 的主幹堆疊結構。(B) 圖為只顯示胜肽骨架的結構疊圖， (C) 為彩帶結構疊圖。 98 圖3-29: MP-BL9在310K 時，能量最小的20 個結構疊圖，顯示形成α-helix 結構的位置為K4 到V13(左邊為N端，右邊為C 端)。(A)為殘基4-13 的主幹堆疊結構。(B) 圖為只顯示胜肽骨架的結構疊圖，(C) 為彩帶結構疊圖。 99 圖3-30: MP-BA13 在310 K，20 個能量最小結構的Ramachandran plot 圖，顯示殘基主要座落在右旋的α-helix 區塊上。 100 圖3-31: MP-BL9 在310 K，20 個能量最小結構的Ramachandran plot 圖，顯示殘基主要座落在右旋的α-helix 區塊上。 101 圖3-32: 胜肽濃度對E.coli 抑制生長率趨勢圖 (A)MP-BA13(B)MP-BL9 106 圖4-1: MP-B、MP-BA13與MP-BL9的結構比較。濃度5 mM，30 % TFE 中，溫度310 K 時的結構，(a)MP-B 形成α-helix 位置在K4-V13， (b) MP-BA13 形成α-helix 位置在K4-A13。(c) MP-BL9 形成的α-helix 位置在K4-V13。 109 圖4-2: MP-B、MP-BA13、MP-BL9 在30 % TFE 溫度310 K 的αH 二 次化學位移比較圖。MP-B (黑色)，MP-BA13 (灰白色)，MP-BL9 (灰 色)。 110 圖4-3: DOSY 光譜求得MP-B、MP-BA13 及MP-BL9 在不同溫度下擴 散係數。 111 圖4-4: DOSY 光譜求得MP-B、MP-BA13 及MP-BL9 在不同溫度下計 算出的實驗分子量(Mexp)與理論分子量(M)的關係。 112 圖4-6: MP-B、MP-BA13、MP-BL9 自結合時與殘基靜電作用力示意 圖。 114 圖4-7: 親水性，疏水性殘基示意圖(a)MP-B(b)MP-BA13(c)MP-BL9。 115 圖4-8: Trp9 及Trp9 的結合時產生之π-π interaction 和Trp9 及Lys12 之π-陽離子示意圖。 117 圖4-9: NOESY光譜中(a) 與MP-B Trp9側鏈有NOE之殘基示意圖， (b) 與MP-B Trp9 側鏈有NOE 之殘基俯視圖。 119[[note]]學號: 601160194, 學年度: 10