[[alternative]]How C-terminal residue alters the helix folding of an amphipathic antimicrobial peptide : CD and NMR study

碩士[[abstract]]如何從蛋白質序列摺疊成其獨特的三維結構，一直是重要的研究課題之一。在其他文獻報告指出，蛋白質的C末端殘基會影響蛋白質的摺疊行為。由於蛋白質的胺基酸數目較多，實驗的複雜性較高，為了降低實驗的複雜性，此論文中選用胺基酸數目較少的MP-B胜肽(14個胺基酸)及其衍生物，將其溶於30% TFE的水溶液中，溫度為310 K，利用CD和NMR進行研究，觀察胜肽的C末端殘基對於蛋白質摺疊行為的影響。 從CD實驗中說明，MP-B及其衍生物在30% TFE溶液中會形成α-helix結構。利用不同溫度的DOSY實驗觀察MP-B及其衍生物的疏水性與寡聚體之間的關係，並討論寡聚狀態的熱穩定性。從抗菌活性實驗的結果發現MP-B及其衍生物的抗菌效果為MP-B > MP-BL15 > MP-B1-13。將MP-B及其衍生物的NOE距離限制放入結構計算中，統計每條胜肽的100個螺旋摺疊結構，並探討C末端對於摺疊結構熱穩定性的重要性。 統合所有的實驗結果，當胜肽C末端無序的殘基無法提供足夠的熵時，會以螺旋N端展開的方式來增加熵。胜肽具有較穩定的結構和寡聚狀態時，會有較佳的抗菌活性，因此，如欲設計一個具有抗菌活性的胜肽，其C末端殘基的作用具有很關鍵的影響。[[abstract]]One of the most interesting questions in biophysics is how protein sequences determine their unique three-dimensional structure. Previous studies reported that the residues at C-terminal can have effects on the protein folding behaviors. Since a large protein is highly complex, for simplicity, in this study we use MP-B (14 amino acids) and its analogues in 30% TFE-d3 aqueous solution as a model system. By using circular dichroism (CD) and NMR methods, we can get insight into how the C-terminal segment may influence the folding behavior of proteins. Spectra of CD indicated that our peptides may form α-helical conformations in 30%TFE. Oligomerization and thermal stability of peptides were investigated by performing diffusional experiments with variable temperatures. The antimicrobial activity of MP-B1-13, MP-B and MP-BL15, is ordered as MP-B > MP-BL15 > MP-B1-13. 100 of structures of different kind foldings were calculated with NMR data to investigate the effects of C-terminal segment on folding. Our results suggested that while the disordered residues at C-terminal can’t provide enough motional entropy, the helical N-terminal may be partially unfolded to increase the entropy. When peptides have more stable structure and oligomeric state, they may have greater antimicrobial activity. The results implied the disordered C-terminal residues may play a critical role for the structure and activity of a peptide. The knowledge is especially important while a peptide segment is designed or truncated for studies of structure and function.[[tableofcontents]]目錄 目錄 .......................................................................................................................................... I 圖目錄 .................................................................................................................................... V 表目錄 ................................................................................................................................XIV 縮寫表.................................................................................................................. XVIII 第一章 緒論 .............................................................................................................. 1 1.1 蛋白質結構 (protein structure) ...................................................................... 1 1.1-1 蛋白質的三維結構 ...................................................................................... 1 1.2 蛋白質摺疊 (protein folding) .......................................................................... 7 1.3 寡聚蛋白質的摺疊與聚集 (oligomeric protein folding and association) ...................................................................................................................... 11 1.4 抗菌胜肽(antimicrobial peptides) ................................................................ 12 1.5 Mastoparan-B (MP-B) 介紹 ............................................................................ 13 1.6 研究目的 ................................................................................................................. 14 第二章 實驗原理................................................................................................... 15 2.1 固相胜肽合成法 (Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS) ................ 15 2.2 圓二色旋光光譜儀 (Circular Dichroism Spectrometer, CD) ......... 20 2.2-1 圓二色光譜儀原理 .................................................................................... 20 2.2-2 多胜肽的各種二級結構與其CD 光譜 ............................................ 22 2.2-3 計算α-helix 含量 ...................................................................................... 23 2.3 二維核磁共振 (Two dimensional nuclear magnetic resonance, 2D NMR) ................................................................................................................................. 24 2.3-1 Correlation Spectroscopy, COSY .......................................................... 28 2.3-2 Total Correlation Spectroscopy, TOCSY ........................................... 31 2.3-3 Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, NOESY ........................ 33 2.4 Diffusion Ordered Spectroscopy, DOSY .................................................... 35 2.4-1 擴散 (Diffusion) ......................................................................................... 35 2.4-2 脈衝磁場梯度核磁共振 (Pulsed field gradient NMR, PFG-NMR) .................................................................................................................. 35 2.4-3 自結合（Self-association） ................................................................... 36 2.5 分子動力學 (Molecular dynamics) ............................................................ 38 2.5-1 NMR 弛緩 (NMR Relaxation) .............................................................. 38 2.5-2 NMR 弛緩與動力學的關係.................................................................... 39 2.5-3 弛緩參數 (Relaxation Parameters) 和光譜密度函數 (spectral density function) 之間的關係 ......................................................... 40 2.5-4 無模型法則 (Model-free approach) ................................................... 42 第三章 實驗材料與方法..................................................................................... 46 3.1 實驗材料 ................................................................................................................. 46 3.2 實驗方法 ................................................................................................................. 51 3.2-1 固相胜肽合成 .............................................................................................. 52 3.2-2 胜肽純化與分子量鑑定 .......................................................................... 54 3.2-3 圓二色旋光光譜儀 .................................................................................... 56 3.2-4 抗菌活性 ........................................................................................................ 57 3.2-5 核磁共振實驗 .............................................................................................. 60 3.2-6 結構計算 ........................................................................................................ 65 3.2.7 無模型法則 (Model-free approach) 計算....................................... 69 3.2-8 黏度實驗 ........................................................................................................ 73 第四章 實驗結果................................................................................................... 74 4.1 圓二色旋光光譜 .................................................................................................. 74 4.2 抗菌活性 ................................................................................................................. 77 4.3 NMR 光譜的判定 ................................................................................................ 80 4.4 DOSY 光譜 ........................................................................................................... 126 4.5 結構計算 ............................................................................................................... 137 4.6 胜肽分子的動力學行為 ................................................................................ 143 第五章 討論 .......................................................................................................... 147 5.1 利用 CD 和NMR 研究胜肽的螺旋摺疊結構 .................................... 147 5.2 改變胜肽C 末端殘基對於其疏水性和疏水力矩的影響 ............... 152 5.2-1 疏水性 (H) .................................................................................................. 154 5.2-2 疏水力矩 (μH) .......................................................................................... 157 5.3 胜肽的自結合狀態對於螺旋摺疊的影響 ............................................. 159 5.4 胜肽的兩親性對於抗菌活性的重要性 .................................................. 161 5.5 胜肽的動力學行為........................................................................................... 162 第六章 結論 .......................................................................................................... 164 第七章 參考資料................................................................................................. 166 圖目錄 圖1-1：天然胺基酸的結構示意圖。 ..................................................................... 2 圖1-2：20 種天然胺基酸結構。 .............................................................................. 3 圖1-3：胺基酸利用胜肽鍵連結形成長鏈聚合物。 ...................................... 4 圖1-4：蛋白質的二級結構。 .................................................................................... 4 圖1-5：Ramachandran plot。 ..................................................................................... 5 圖1-6：蛋白質的三級結構。 .................................................................................... 5 圖1-7：蛋白質的四級結構。 .................................................................................... 6 圖1-8：蛋白質的摺疊機制。 .................................................................................... 9 圖1-9：漏斗能量表面。 ............................................................................................ 10 圖1-10：蛋白質大小和時間尺度的關係圖。 ................................................. 10 圖2-1：利用連接試劑將胜肽的C 端接到Resin 上。 ................................ 16 圖2-2：連接試劑。 ...................................................................................................... 16 圖2-3：胺基酸的N 端加上Fmoc 保護基，以防止其他反應發生。 . 17 圖2-4：胺基酸側鏈的保護基。 ............................................................................. 17 圖2-5：胺基酸的活化與耦合。 ............................................................................. 18 圖2-6：胺基酸去保護。 ............................................................................................ 18 圖2-7：切除Resin 和側鏈上的保護基。 .......................................................... 19 圖2-8：光通過偏光過濾器產生平面偏極光。 ............................................... 20 圖2-9：偏極光示意圖。 ............................................................................................ 21 圖2-10：多胜肽的五種不同二級結構之CD 光譜。 .................................. 23 圖2-11：二維核磁共振實驗的脈衝序列。 ...................................................... 24 圖2-12：施加一個90°x 脈衝。 ............................................................................... 24 圖2-13：線性遞增的t1 時間。 ............................................................................... 25 圖2-14：FID 經傅立葉轉換，從time domain 轉換成frequency domain。 .................................................................................................................................................. 27 圖2-15：COSY 的脈衝序列。 ................................................................................ 28 圖2-16：COSY 光譜的雙自旋系統示意圖。 .................................................. 30 圖2-17：TOCSY 的脈衝序列。 ............................................................................. 31 圖2-18：TOCSY 光譜的自旋系統示意圖。.................................................... 32 圖2-19：雙自旋系統 (I、S) 的偶極耦合。 ................................................... 33 圖2-20：NOESY 的脈衝序列。 ............................................................................. 33 圖2-21：兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。 ................................................. 34 圖2-22：局部與總體的物理模型示意圖。 ...................................................... 44 圖3-1：實驗流程圖。 ................................................................................................. 51 圖3-2：固相胜肽合成流程圖。 ............................................................................. 53 圖3-3：純化後MP-B1-13 的HPLC 層析圖。 ................................................... 55 圖3-4：MP-B1-13 的MALDI-TOF MS 圖譜。 ................................................. 55 圖3-5：理想的劑量反應曲線。 ............................................................................. 59 圖4-1：MP-B 在溫度300 K 下，不同TFE 濃度的CD 光譜。 ............ 74 圖4-2：胜肽在30% TFE / 70% H2O 溶液中，溫度分別為283 K、298 K、300 K 和310 K 的CD 光譜疊圖。 ............................................................... 75 圖4-3：MP-B1-13 對E.coli 的劑量反應曲線。 ................................................ 77 圖4-4：MP-B 對E.coli 的劑量反應曲線。 ...................................................... 78 圖4-5：MP-BL15 對E.coli 的劑量反應曲線。 ................................................. 78 圖4-6：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的TOCSY 光譜。 .................................................................................................................................................. 81 圖4-7：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的TOCSY 光譜。 . 82 圖4-8：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的TOCSY 光譜。 .................................................................................................................................................. 83 圖4-9：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 84 圖4-10：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 85 圖4-11：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 86 圖4-12：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hβ-HN 交叉峰區塊。 ............................................................................................... 87 圖4-13：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hβ-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 88 圖4-14：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hβ-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 89 圖4-15：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的HN-HN 交叉峰區塊。 ............................................................................................... 90 圖4-16：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 HN-HN 交叉峰區塊。 ..................................................................................................... 91 圖4-17：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 HN-HN 交叉峰區塊。 ..................................................................................................... 92 圖4-18：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hα-HN 交叉峰區塊。 ............................................................................................... 94 圖4-19：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 95 圖4-20：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 96 圖4-21：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hβ-HN 交叉峰區塊。 ............................................................................................... 97 圖4-22：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hβ-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 98 圖4-23：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hβ-HN 交叉峰區塊。 ...................................................................................................... 99 圖4-24：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hγ-HN 交叉峰區塊。.............................................................................................. 100 圖4-25：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hγ-HN 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 101 圖4-26：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hγ-HN 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 102 圖4-27：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hα-Hβ 交叉峰區塊。 .............................................................................................. 103 圖4-28：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-Hβ 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 104 圖4-29：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-Hβ 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 105 圖4-30：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 的Hα-Hγ 交叉峰區塊。顯示dαγ(i, i+3)的NOE 訊號。 .............................. 106 圖4-31：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-Hγ 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 107 圖4-32：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜的 Hα-Hγ 交叉峰區塊。 .................................................................................................... 108 圖4-33：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 芳香環側鏈區域。 ....................................................................................................... 109 圖4-34：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜芳香 環側鏈區域。 ................................................................................................................. 110 圖4-35：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜芳 香環側鏈區域。 ............................................................................................................ 111 圖4-36：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜 尾端胺基區域。 ............................................................................................................ 112 圖4-37：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜尾端 胺基區域。 ....................................................................................................................... 113 圖4-38：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 的NOESY 光譜尾 端胺基區域。 ................................................................................................................. 114 圖4-39：二次化學位移 (secondary chemical shift)。 ............................... 119 圖4-40：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310 K 時的NOE 訊號。 ................................................................................................................................. 120 圖4-41：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310 K時的NOE 訊號。 ................................................................................................................................................ 121 圖4-42：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310 K 時的NOE 訊 號。 ...................................................................................................................................... 121 圖4-43：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310 K 的1H-13C HSQC 光譜。 .................................................................................................................. 122 圖4-44：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310 K 的1H-13C HSQC 光譜。 ................................................................................................................................. 123 圖4-45：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，溫度310K的1H-13C HSQC 光譜。 ................................................................................................................................. 124 圖4-46：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，八個不同溫度下的DOSY 光譜疊圖。 ....................................................................................................................... 127 圖4-47：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，八個不同溫度下的DOSY 光譜疊圖。 ....................................................................................................................... 128 圖4-48：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，八個不同溫度下的DOSY 光譜疊圖。 ....................................................................................................................... 129 圖4-49：MP-B1-13 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 下的DOSY 光譜 圖。 ...................................................................................................................................... 130 圖4-50：MP-B 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 下的DOSY 光譜圖。 ................................................................................................................................................ 131 圖4-51：MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O，310 K 下的DOSY 光譜 圖。 ...................................................................................................................................... 132 圖4-52：MP-B1-13、MP-B 和MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O 溶液 中，不同溫度下的擴散係數。 .............................................................................. 136 圖4-53：MP-B1-13、MP-B 和MP-BL15 在30% TFE-d3 / 70% H2O 溶液 中，不同溫度下的自結合狀態。 .................................................................. 136 圖4-54：MP-B1-13 在100 個結構之中四種主要的螺旋摺疊結構，其骨 幹的疊圖。 ....................................................................................................................... 138 圖4-55：MP-B 在100 個結構之中四種主要的螺旋摺疊結構，其骨幹 的疊圖。 ............................................................................................................................ 139 圖4-56：MP-BL15 在100 個結構之中四種主要的螺旋摺疊結構，其骨 幹的疊圖。 ....................................................................................................................... 140 圖4-57：20 個最低能量結構的Ramachandran plot 圖。 ........................ 141 圖5-1：MP-B1-13、MP-B 與MP-BL15 的隨著溫度變化的α-helix 含量 (%)。 ................................................................................................................................... 147 圖5-2：C 末端胺基跟其他殘基之間的氫鍵長度。 ................................... 150 圖5-3：MP-B-COO-沒有尾端胺基與其他殘基之間的氫鍵。 .............. 151 圖5-4：滯留係數與HPLC 滯留時間的關係圖。 ....................................... 156 圖5-5：HPLC 滯留時間與疏水性的關係圖。 .............................................. 156 圖5-6：胜肽的兩親性示意圖。 ........................................................................... 158 圖5-7：MP-BL15 每個殘基的次序參數 (S2)。 .............................................. 163 圖5-8