[[alternative]]Characterization of structural, dynamic and functional relationships of a mutant analogous from mastoparan-B by NMR

碩士[[abstract]]黑腹胡蜂為目前台灣最危險、最具攻擊性的胡蜂之一，其蜂毒液中富含多種具生物活性的分子，經研究結果顯示極具醫藥價值。黑腹胡蜂的蜂毒液中，最主要的一種成分即為mastoparan-B，簡稱MP-B。MP-B是一種由14個胺基酸組成的小分子胜肽(LKLKSIVSWAKKVL-NH2)，其功能包括A2、C磷脂酸酶的活化、抗菌作用、溶血作用、組織胺的釋放、活化G蛋白等，在水溶液中會形成兩性α螺旋結構，使其可以和細胞膜結合，形成穿孔作用。 MP-B-9F，將MP-B的W9制換成Phe的小分子胜肽，利用固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成MP-B-9F，經由高效能液相層析儀(HPLC)純化，質譜儀(ESI-MASS)確認分子量，利用大腸桿菌(E. coli)對MP-B和MP-B-9F做抗菌活性測定，再以圓二色光譜儀(CD)和二維核磁共振(2-D NMR)的光譜：TOCSY、NOESY、[1H,13C]-HSQC光譜判定得到化學位移與限制條件，弛緩實驗(relaxation)測得MP-B-9F內部運動的參數T1、T2與NOE，DOSY實驗測得MP-B-9F擴散係數，計算出流體力學半徑，可知MP-B-9F為寡聚體結構。 經由Xplor-nih計算軟體模擬出MP-B-9F的二級結構，得知其在283K 30%TFE環境下之螺旋結構位於S5-S8。由模擬焠熄實驗之後得到的結果推疊出MP-B-9F主幹RMSD為0.227。 利用無模型法則(Model-free approach)與光譜密度函數(Spectral density function)進行分子動態行為計算，計算出MP-B-9F與MP-B各殘基的次序參數(order parameter, S2)與全關連時間(Overall correlation time, τm)。 綜合比較以上實驗結果，發現MP-B以Phe取代Trp9之後可能導致溶血活性下降的原因與結構的變化有極大的關係。[[abstract]]In Taiwan, the black-bellied hornet (vespa basalis) is certainly the most dangerous and most aggressive one in all kinds of vaspine wesp. Mastoparan-B (MP-B), a main component of the venom of black-bellied hornet, is a potent anti-bacteria peptide consisting of 14 amino acid residues (LKLKSIVSWAKKVL-NH2). Previous study had shown that hemolytic activity of MP-B is almost abolished as tryptophan at position 9 is mutated by phenylalanine. MP-B-9F, a mutant analogous at position 9 was mutated by phenylalanine, was synthesized by Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS), purified by HPLC and checked the molecular weight of peptide by ESI-MASS. The structure has been characterized by CD and 2D-NMR spectroscopy. As comparing with MP-B, the α-helix content in MP-B-9F is less at 283K but is more stable as temperature increased. The structure was simulated by Xplor-nih, and shows that residues 5-8 adopt a helical conformation in 283K, 30% TFE/water mixture. The 13C relaxation parameters of MP-B and MP-B-9F were determined in 30% TFE/water mixture. The relaxation parameters, T1, T2, and NOE were analyzed using model-free approach. We calculated the order parameters, S2 and overall correlation times, τm of both peptides.[[tableofcontents]]第一章 緒 論 1.1抗菌胜肽……………………………………………………………1 1.2蜂毒液介紹……………………………………………………………3 1.3 Mastoparan家族……………………………………………………4 1.4 MP-B介紹……………………………………………………………5 1.5 研究目的……………………………………………………………6 第二章 實 驗 原 理 2.1 固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS)……7 2.2 抗菌活性測定………………………………………………………8 2.3 圓二色旋光光譜儀（Circular Dichroism Spectrometer）…10 原理………………………………………………………………………10 胜肽二級結構之CD光譜…………………………………………………13 2.4核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR) ………………15 弛緩(Relaxation)………………………………………………………18 NOE效應…………………………………………………………………20 2.5 二維核磁共振原理(2D NMR) ……………………………………22 DOSY光譜 ………………………………………………………………24 COSY光譜 ………………………………………………………………27 TOCSY光譜 ………………………………………………………………29 NOESY光譜 ………………………………………………………………30 HSQC光譜………………………………………………………………33 2.6 二次化學位移( Secondary Chemical Shift)…………………34 2.7 XPLOR原理…………………………………………………………37 2.8 無模型法則(Model-free Approach)……………………………38 函數模型選擇(model selection)……………………………………40 第三章 實驗材料與方法 3.1 實驗材料…………………………………………………………42 3.1.1藥品………………………………………………………………42 3.1.2實驗儀器…………………………………………………………44 3.2實驗方法……………………………………………………………45 3.2.1 胜肽合成SPPS……………………………………………………46 3.2.3抗菌活性測試……………………………………………………48 3.2.4 CD光譜…………………………………………………………49 3.2.5 NMR………………………………………………………………50 3.2.6結構計算…………………………………………………………52 3.2.7 無模型法則(model-free approach)計算……………………53 第四章 結果與討論 4.1胜肽純化與分子量測量……………………………………………56 4.2抗菌活性測試 (Antibacterial Activity)………………………57 4.3 CD光譜………………………………………………………………58 4.4核磁共振NMR…………………………………………………………61 4.4.1 DOSY光譜…………………………………………………………61 4.4.2光譜判定…………………………………………………………64 4.4.3 二次化學位移 ( Secondary Chemical Shift)………………77 4.4.4 結構計算…………………………………………………………81 4.5 分子動力學(dynamics)……………………………………………84 4.5.1 13C弛緩實驗relaxation………………………………………84 4.5.2無模型法則(Model-free)………………………………………89 4.5.3光譜密度函數(Spectral Density Functions )………………92 第五章 結論……………………………………………………………95 第六章 參考資料………………………………………………………100 表 目 錄 VI 表 2- 1：CD 光譜胜肽二級結構的特定吸收波長。................................14 表 2- 2：連續和非連續的NOE 可預測產生特定的二級結構。.............32 表 2- 3：二十種必需胺基酸於無序纏捲時的質子化學位移表...............35 表 2- 4：二十種必需胺基酸的Cα、CO、Cβ 的化學位移範圍..............36 表 3- 1：合成時所使用的活化、偶合和去保護的時間。……………46 表 3- 2：純化所使用的梯度參數。...........................................................47 表 3- 3：MP-B 的參數設定。....................................................................50 表 3- 4：MP-B-9F 的參數設定...................................................................50 表 3- 5：MP-B 的參數設定。....................................................................51 表 3- 6：MP-B-9F 的參數設定。...............................................................51 表 3- 7：mfinput 檔之變數。......................................................................54 表 4- 1：MP-B 經DOSY 實驗的結果整理表。.......................................64 表4- 2：MP-B-9F 經DOSY 實驗的結果整理表。..................................64 表4- 3：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的1H 化學位移。................74 表4- 4：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的13C 化學位移。...............75 表4- 5：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的NOE 訊號整理表。........76 表4- 6：MP-B 的Trp 和MP-B-9F 的Phe 分別與I6-V13 的NOE 訊號。 ................................................................................................................83 表4- 7：MP-B 各殘基13Cα 的T1、T2 與NOE 值。...............................86 表4- 8：MP-B-9F 各殘基13Cα 的T1、T2 與NOE 值。..........................86 表4- 9：MP-B 與MP-B-9F 之全關聯時間(ηm)與平均次序參數(S2)值。 ................................................................................................................90 表4- 10：MP-B 各殘基的S2 值與NOE 訊號數量總整理。...................91 表4- 11：MP-B-9F 各殘基的S2 值與NOE 訊號數量總整理。.............91 表5- 1：MP-B 與MP-B-9F 各項結果綜合比較表。……………..……99 圖 目 錄 VII 圖 1- 1：Mastoparan 家族的初級結構示意。.............................................4 圖 1- 2：C.C. Chuang et al.於1995 年模擬出20 個MP-B 立體結構的疊 圖。..................................................................................................5 圖 2- 1：固相胜肽合成法.............................................................................7 圖 2- 2：細胞膜主要是由脂質分子（lipid）排列成雙層結構，脂質分子 有疏水的碳氫鏈和親水的磷酸根。................................................8 圖 2- 3：抗菌胜肽穿孔示意圖。.................................................................9 圖 2- 4：抗菌胜肽對抗病原菌機制。.........................................................9 圖 2- 5：光的電場(E)與磁場(M)示意圖。................................................10 圖 2- 6：光通過平面極化器（polarizer）後產生單一線性光源。.........11 圖 2- 7：左圖為通過非旋光性物質；右圖為通過右旋光物質所產生的相 角。..................................................................................................11 圖 2- 8：蛋白質或胜肽的四種主要結構的圓二色旋光光譜。...............13 圖 2- 9：I≠0 的原子核在磁場B0 之下都有核磁矩。...............................15 圖 2- 10：(a)為在B0 磁場下，在Z 軸上的磁矩(b)為其能階。............16 圖 2- 11：原子核吸收RF pulse 能量，產生能階狀態的躍遷。.............16 圖 2- 12：整個系統磁矩向量總和M0 示意圖。......................................17 圖 2- 13：M0 受電磁脈衝偏轉到XY 平面。............................................18 圖 2- 14：M0 在Z 軸與XY 平面弛緩的簡易圖。...................................18 圖 2- 15：Mz’和Mx’-y’與T1、T2 關係式與關係圖。................................20 圖 2- 16：弛緩過程中，原子核能階變化圖。.........................................20 圖 2-17：二階系統能階及其交叉弛緩路徑(cross-relaxation pathways)。 ........................................................................................................21 圖 2- 18：二維核磁共振實驗的脈衝序列。.............................................22 圖 2- 19：在二維核磁共振實驗中，將t1 做線性增加。.........................23 圖 2- 20：DOSY 的脈衝序列。.................................................................24 圖 2- 21：COSY 的脈衝序列。.................................................................27 圖 2- 22：TOCSY 的脈衝序列。...............................................................29 圖 2- 23：兩相鄰胺基酸之間質子的距離。.............................................30 圖 2- 24：NOESY 的脈衝序列。...............................................................30 圖 2- 25：運用NOE 數據計算出分子結構。...........................................32 圖 2- 26：HSQC 的脈衝序列。.................................................................33 圖 2- 27：局部與整體的物理模型示意圖。.............................................40 圖 4- 1：HPLC 分析圖，主要峰出現在14.5 分鐘。……………….56 圖 4- 2：ESI+-Mass 分析圖，測得其分子量為1572.9 Da。...................56 圖 4- 3：利用E. coli 比較MP-B 和MP-B-9F 之抗菌活性。.................57 圖 4- 4：MP-B-9F 在283K 不同TFE 濃度下的CD 光譜圖。...............59 圖 4- 5：MP-B與MP-B-9F 在30 %TFE不同溫度下的CD光譜圖與α-helix VIII 含量比較。....................................................................................60 圖4- 6：MP-B-9F 在30%TFE-d3 環境中，不同溫度下的DOSY 光譜疊 圖。.........................................................................................................61 圖 4- 7：MP-B(♦)和MP-B-9F(■)由DOSY 光譜求得在不同溫度下的擴散 系數(A)、黏度(B)與實驗分子量(Mexp)和理論分子量(M)之倍數關係比 較(C)。MP-B 和MP-B-9F 皆為3.7mM。...........................................63 圖 4- 8：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的TOCSY 光譜。顯示MP-B-9F 上垂直連結NH 與各質子的J 偶合交叉峰訊號。.............................66 圖 4- 9：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的NOESY 光譜。顯示dαN(i,i+1) 的NOE 連結。.......................................................................................67 圖 4- 10：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的NOESY 光譜。顯示dβN(i,i+1) 的NOE 連結。.......................................................................................68 圖 4- 11：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的NOESY 光譜。顯示dNN(i,i+1) 的NOE 連結。.......................................................................................69 圖 4- 12：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K的NOESY光譜。顯示dαN(i,i+2)、 dαN(i,i+3)、dαN(i,i+4)的NOE 連結。....................................................70 圖 4- 13：MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K的NOESY光譜。顯示dβN(i,i+2)、 dβN(i,i+3)、dβN(i,i+4)的NOE 連結。....................................................71 圖4- 14：MP-B-9F在30% TFE-d3，283 K的NOESY光譜。顯示dαβ(i,i+3)、 dαβ(i,i+4)的NOE 連結。........................................................................72 圖 4- 15: MP-B-9F 在30% TFE-d3，283 K 的[13C,1H]-HSQC 光譜。....73 圖 4- 16：MP-B-9F 在30% TFE-d3，310 K 的NOESY 光譜。顯示dNN(i,i+1) 的NOE 連結。.......................................................................................77 圖 4- 17：283 K 下各殘基與無序纏捲的Hα 化學位移差值與其CSI。78 圖 4- 18：283 K 下各殘基與無序纏捲的NH 化學位移差值。..............79 圖 4- 19：283 K 下各殘基與無序纏捲的Cα 化學位移差值與其CSI。80 圖 4- 20：MP-B-9F 在283K 時，11 個能量最小的結構疊圖。............81 圖 4- 21：MP-B-9F 在283K 時的結構絲帶圖，α-helix 位於S5-S8。..82 圖 4- 22：MP-B 在283K 時的結構絲帶圖，α-helix 位於K4-V13。....82 圖 4- 23：由Ramachandran plot 圖，顯示MP-B-9F 在283 K 時，雙面角 座落於右旋的α-helix 上，圖示上數字1-14 分別為殘基L1-L14。.82 圖 4- 24：MP-B(♦)與MP-B-9F(■)在283 K 時的T1、T2、NOE。........87 圖 4- 25：弛緩實驗的最佳曲線適化(curve fitting)。分別為MP-B 殘基 Trp(♦)與MP-B-9F 殘基Phe (▲)在283 K 時的T1 與T2。................88 圖 4- 26：MP-B 與MP-B-9F 各殘基之次序參數值(S2)與NOE 訊號數量 比較。(長條圖之■為MP-B；■為MP-B-9F) ......................................90 圖 4- 27：將MP-B(■)與MP-B-9F(▲)的R1、R2 與NOE 帶入J(0)(A)與 J(ωH+ωC)(B)之值。................................................................................93[[note]]學號: 698160628, 學年度: 9